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目的:近年来地西他滨(decitabine,DAC)在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的治疗中取得了较大进展,但部分患者在应用DAC治疗过程中由于原发耐药或者继发耐药而导致治疗失败和疾病进展。我们的前期研究发现DNA结合抑制因子1(inhibitor of DNA binding 1,ID1)可能参与DAC耐药,本研究拟采用过表达和沉默ID1表达的方法,分析ID1对白血病细胞生物学功能的影响,探讨其在DAC耐药中的作用机制。方法:(1)采用基因过表达技术将ID1通过慢病毒转染白血病细胞株K562和HL60,获得稳定过表达ID1的K562和HL60细胞(ID1-K562、ID1-HL60)及其对照组细胞(NCK562、NC-HL60);采用基因沉默技术将shID1基因通过慢病毒转染DAC耐药K562细胞株(K562/DAC),经筛选获得ID1沉默的K562/DAC细胞(shID1-K562/DAC)及其对照组细胞(shNC-K562/DAC);采用实时荧光定量PCR法(real-time quantitative PCR,RQPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测转染细胞株中ID1的表达水平。(2)采用细胞计数法和膜连蛋白-V藻红蛋白/7-氨基放线菌素D(Annexin VPhycoerythrin/7-Aminoactinomycin D,Annexin V-PE/7-AAD)分析ID1对转染细胞生长、凋亡的影响。(3)将ID1-K562、ID1-HL60、shID1-K562/DAC细胞和对照细胞分别用不同浓度DAC处理后,采用台盼蓝拒染法计数存活细胞数,并使用SPSS计算半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50),分析白血病细胞和耐药细胞中ID1表达对DAC耐药性的影响。(4)将NC-K562和ID1-K562细胞接种于裸鼠背部皮下,建立裸鼠皮下移植瘤模型,采用DAC进行治疗,同时设生理盐水(normal saline,NS)对照组,观察指标包括小鼠体重、生存时间、药物敏感性等。处死裸鼠取皮下瘤组织,采用RQ-PCR和Western blot等方法检测ID1mRNA和蛋白表达水平,取肿瘤组织进行苏木精-伊红染色法(hematoxylineosin staining,HE)染色检测其病理情况。(5)采用RQ-PCR方法检测经过不同浓度DAC处理的K562细胞中ID1的表达,采用亚硫酸氢盐测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测ID1启动子区甲基化水平。建立过表达miR-29b的K562/DAC(miR-29b-K562/DAC)细胞及其对照细胞(NC-K562/DAC)分析ID1的表达情况;应用不同DAC浓度处理,采用台盼蓝拒染法计数细胞存活数,利用SPSS软件计算各组细胞的IC50值。分析ID1作为miR-29b的靶基因,通过miR-29b-ID1信号途径参与白血病细胞DAC耐药的作用。结果:(1)ID1过表达对白血病细胞生物学功能的影响RQ-PCR和Western blot检测慢病毒转染后ID1-K562和ID1-HL60的表达情况,与对照组相比,结果显示,ID1-K562和ID1-HL60组中ID1的表达增高(P<0.05)。细胞生长实验中,与对照组相比,ID1-K562和ID1-HL60组细胞生长速度显著增加(P<0.05);使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,与对照组比较,ID1-K562和ID1-HL60细胞的早期凋亡显著降低(P<0.05),总体凋亡率无统计学意义(P>0.05)。用不同浓度的DAC分别处理K562、NC-K562、ID1-K562和HL60、NC-HL60、ID1-HL60细胞,通过SPSS计算IC50值。结果显示与K562和NC-K562组相比,ID1-K562组对DAC的耐药性明显增加(P<0.05);与HL60和NC-HL60相比,ID1-HL60组对DAC的耐药性明显增加(P<0.05)。表明ID1可增加K562和HL60对DAC的耐药性。为探索过表达ID1在裸鼠体内对肿瘤生长和DAC耐药性的影响,建立了裸鼠白血病细胞皮下移植瘤模型。结果显示与NC-K562注射NS组相比,ID1-K562注射NS组肿瘤体积增加(P<0.05);提示ID1可能促进裸鼠皮下肿瘤的生长。与NC-K562注射DAC组相比,ID1-K562注射DAC组肿瘤体积增加(P<0.05),提示ID1可能在裸鼠体内增加白血病K562细胞对DAC的耐药性。(2)沉默ID1对DAC耐药白血病细胞的生物学功能影响RQ-PCR和Western blot检测慢病毒转染后shNC-K56/DAC和shID1-K562/DAC的表达情况,与对照组相比,shID1-K562/DAC组ID1表达水平降低(P<0.05)。细胞增殖实验结果显示,与对照组相比沉默ID1组细胞(sh ID1-K562/DAC)生长速度降低,有统计学意义(P<0.05)。将shNC-K562/DAC及shID1-K562/DAC细胞经不同DAC浓度处理,计数细胞存活数,利用SPSS软件计算各组细胞的IC50值。结果显示:shNC-K562/DAC的IC50约为(2.25±0.19)μM/L,shID1-K562/DAC的IC50为(1.13±0.13)μM/L。提示沉默ID1的K562/DAC细胞株中细胞存活率较对照组降低,两组有统计学意义(P<0.05);提示ID1沉默能够增加K562/DAC细胞对DAC的敏感性。(3)miR-29b-ID1信号对K562/DAC的生物学功能影响采用RQ-PCR方法检测经过不同浓度DAC处理的K562细胞中ID1的表达,结果显示与未经DAC处理的K562细胞相比,经过DAC处理的K562细胞ID1的表达显著降低;而在K562/DAC细胞中ID1表达上调,提示在DAC耐药细胞中存在ID1表达的调控异常。采用BSP测序方法检测ID1启动子区甲基化水平,结果显示K562细胞中ID1呈完全未甲基化状态,DAC处理的K562细胞ID1是高未甲基化状态,提示ID1表达不被甲基化调控,DAC可能通过调节ID1的上游miR-29b参与DAC耐药。为此同样采用慢病毒转染技术构建miR-29b过表达细胞株(miR-29b-K562/DAC)和相应对照组(NCK562/DAC)。将NC-K562/DAC和miR-29b-K562/DAC细胞用不同DAC浓度处理,台盼蓝拒染法计数细胞存活数,利用SPSS软件计算IC50值。结果显示:miR-29b-K562/DAC组IC50为(0.72±0.03)μM/L,对照组为(2.17±0.03)μM/L,两组有统计学差异(P<0.05);与对照组相比,miR-29b-K562/DAC细胞组对DAC的敏感性增强,其耐药性降低。采用RQPCR和Western blot法检测miR-29b-K562/DAC细胞中ID1 mRNA和蛋白的表达水平,与对照组相比,miR-29b-K562/DAC中ID1 mRNA和蛋白水平降低。提示过表达miR-29b可能通过降低K562/DAC细胞中ID1的表达,增加其对DAC的敏感性。结论:(1)ID1可促进白血病细胞生长,降低早期凋亡;(2)ID1可降低白血病细胞对DAC的敏感性;(3)ID1表达不受甲基化调控,miR-29b过表达细胞中ID1表达降低,miR-29b-ID1信号可能参与DAC耐药。