牦牛Cyclin D1、E1基因克隆及IGF-I、TGF-β1对Cyclin D1在睾丸支持细胞表达的影响

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Cyclin D1和Cyclin E1均为细胞G1/S期关键蛋白。本研究旨在克隆牦牛(Bos grunniens)Cyclin D1和Cyclin E1基因的CDS序列,分析其生物学特性,并研究胰岛素样生长因子-I(Insulin-like growth factor-I,IGF-I)和转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)对Cyclin D1在睾丸支持细胞(Sertoli cell,SC)中表达的影响。采用RT-PCR技术克隆牦牛Cyclin D1和Cyclin E1基因,采用免疫荧光染色技术对其蛋白在SCs中的表达进行了定位分析。采用实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法检测不同浓度的IGF-I(0(对照组)、25、50、100、150 ng?m L-1)和不同时间(0(对照组)、5、12、18、24 h)、不同浓度(0、250、500、750、1000 pg?mL-1)的TGF-β1对Cyclin D1基因和蛋白表达的影响。结果如下:(1)牦牛Cyclin D1和Cyclin E1基因与其它物种的同源性均较高,GenBank登录号分别为KY 420723和KY437813。其蛋白在SCs胞核中均高表达,为核蛋白。(2)IGF-I浓度为25和150 ng?mL-1作用组Cyclin D1 mRNA表达量与对照组(0 ng?m L-1)差异不显著(P>0.05),50和100 ng?m L-1作用组Cyclin D1 mRNA表达量显著高于其他各组(P<0.05);100 ng?mL-1作用组Cyclin D1蛋白表达量与对照组差异不显著(P>0.05),25、50和150 ng?mL-1作用组Cyclin D1蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05);IGF-I浓度为50 ng?m L-1时,Cyclin D1 mRNA和蛋白表达量均为最高,分别为对照组的1.65和1.20倍。(3)TGF-β1作用于SCs 5、12和24 h时,Cyclin D1 mRNA的表达量显著高于对照组(P<0.05),作用到18 h时,其表达量显著低于其它组(P<0.05);不同时间处理组的Cyclin D1蛋白表达量都显著高于对照组(P<0.05)。TGF-β1各浓度处理组中Cyclin D1 mRNA和蛋白表达量均显著高于对照组(P<0.05)。TGF-β1以时间和剂量依赖的方式促进Cyclin D1的表达,最佳时间和浓度分别为12 h和750 pg?m L-1。结果表明,Cyclin D1和Cyclin E1在进化过程中高度保守,其蛋白质定位于细胞核;IGF-I和TGF-β1可以通过促进Cyclin D1的表达来调控SCs的生长。本研究为调控SCs的发育提供了实验依据。
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