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H7N9亚型流感病毒是一种新发流感病毒,于2013年3月在上海和安徽两地首次发现,截止到2017年2月22日,全球共报道1230例H7N9亚型流感病毒感染人的病例,其中428例死亡,死亡率达到34.80%。目前,多个国家已经着手开展H7N9亚型流感病毒病诊断、防治等相关产品的研发工作。对于高风险人群,接种疫苗是一种有效的预防手段;对于易感人群和感染患者,被动免疫则是一种有效的紧急预防和治疗手段。因此,有必要研制安全、有效、经济实用的流感疫苗和治疗抗体。流感病毒的致病性主要受到病毒的分子特性和宿主的种属差异影响,构建流感病毒动物感染模型,开展病毒的致病性分子机制研究,将有助于我们有针对性地对该病进行免疫预防和治疗研究。Palladino等用中和单抗治疗免疫缺陷的A型流感病毒感染小鼠,显示出良好的治疗效果,提示抗体疗法可能成为未来对抗H7N9亚型流感有效的手段之一。人源抗体是最理想的治疗抗体,但是短期难以获得大量的人源血清,因此异源抗体(动物源免疫球蛋白)成为现阶段必然的抗体治疗替代手段之一。在各种动物中,马抗血清制品生产和应用已有100多年的历史,具有易于大规模制备、特异性好、制备周期相对较短等优点,在应对传统疾病和新发/突发传染病中发挥了巨大作用。本研究以研制马抗H7N9亚型流感精制免疫球蛋白为研究目标,首先建立了H7N9亚型流感病毒小鼠感染模型,为H7N9流感治疗性抗体研究提供了评价平台;其次,利用昆虫细胞—杆状病毒表达系统,包装出含有A/Shanghai/2/2013(H7N9)毒株HA、NA和M1蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),并对VLPs进行体外生物学活性检测和小鼠体内免疫原性研究;最后,以VLPs作为免疫原免疫马匹,通过优化生产工艺对马高免血清进一步精制,获得了马抗H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白F(ab′)2,并评价其预防和治疗效果。1、H7N9亚型流感病毒小鼠感染模型的构建及致病性分子基础研究选取BALB/c小鼠作为实验动物模型,将A/Shanghai/2/2013(H7N9)毒株通过鼠肺连续传代获得鼠适应株P10M1、P10M2和P10M3。通过小鼠半数致死量、病死率、病毒复制效率、组织嗜性等评价指标,成功建立了H7N9亚型流感病毒小鼠感染模型,为H7N9亚型流感治疗药物和疫苗预防效果评价建立了平台。基因组序列分析发现,PA、HA、NA、M和NP基因上的若干个位点发生变异,推测发现其中PA-T97I可能是H7N9亚型流感病毒对哺乳动物致病性增强的分子基础之一。2、H7N9亚型流感病毒样颗粒制备利用昆虫细胞——杆状病毒表达系统,构建了表达A/Shanghai/2/2013(H7N9)毒株HA、NA和M1的重组杆状病毒,经PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定,目的蛋白获得成功表达。将重组杆状病毒感染昆虫细胞后成功组装成H7N9亚型流感病毒样颗粒在透射电镜下可观察到球形、直径约100nm、表面有典型纤突的流感VLPs,血凝效价为1:27~1:28。将VLPs通过肌肉注射或滴鼻方式,免疫BALB/c小鼠10μg VLPs/只,二免后两周,在H7N9亚型流感病毒小鼠适应株10MLD50剂量的攻击下,可以对小鼠提供100%的免疫保护。因此,所制备的H7N9亚型流感VLPs具有很好的免疫原性,为H7N9亚型流感免疫球蛋白的免疫原制备奠定了基础。3、H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白研究以VLPs制备免疫原免疫马匹,五免后获得HI抗体效价为1:10240的高免血清。利用已构建的H7N9亚型流感病毒小鼠感染模型,用10个MLD50采用滴鼻方式进行攻毒,攻毒前36h、攻毒后24h,各组小鼠分别腹腔注射0.2ml高免血清,小鼠的存活率均达100%,而对照组全部死亡。由此证明,制备的马抗H7N9亚型流感病毒高免血清对该亚型流感病毒感染具有良好的紧急预防和治疗效果。在传统马抗血清纯化工艺的基础上,对制备工艺进行了改进和优化,采用酶切纯化工艺去除抗体的Fc片段,亲和柱层析方法纯化免疫球蛋白F(ab′)2。经SDS-PAGE、薄层扫描,结果表明,所获得的精制免疫球蛋白F(ab′)2的纯度在93%以上。采用固定病毒—稀释免疫球蛋白方法,测得的中和抗体效价为1:5120。利用已构建的H7N9亚型流感病毒小鼠感染模型,用10个MLD50采用滴鼻方式进行攻毒,攻毒前4h、攻毒感染后8h,0.2mg给药剂量即可100%保护小鼠;攻毒24h后,0.4mg给药剂量的小鼠存活率为75%。小鼠实验证明,制备的精制免疫球蛋白F(ab′)2对H7N9亚型流感有较好的预防和治疗效果。综上所述,本研究通过构建感染模型发现了H7N9对哺乳动物致病的关键分子标记。进而,利用所构建的H7N9亚型流感病毒小鼠感染模型证实H7N9亚型流感VLPs具有良好的免疫保护效果,而且马抗H7N9亚型流感VLPs精制免疫球蛋白F(ab′)2在预防和治疗H7N9亚型流感中表现出潜在的应用价值,为H7N9亚型流感治疗药物和疫苗的研制提供了科技支撑。