杜果是我国热带地区的重要水果,已成为热区经济的支柱产业。随着国家对热区经济扶持力度的加大和农业产业结构的调整,杜果产业在帮助热区农民脱贫致富方面起着重要作用。然而,近年来由于全球极端气候频繁发生,低温和干旱等非生物胁迫成为限制杧果生长发育和稳产的重要环境因素,严重制约了杧果产量和品质的提高。研究其在逆境响应过程,可加深对逆境反应的理解,为深入研究杧果逆境胁迫响应的分子机理提供实验依据。对其相关基因功能分析,可以为杜果遗传改良提供理论依据和候选基因资源,为培育杧果新品种奠定基础。本研究以前期逆境胁迫差异显示分析中发现的3个对逆境胁迫响应显著的基因片段为对象,以一年多次开花结果的‘四季’杧果品种为试验材料,分离克隆了2个新的Rab基因(MiRab5和MiRabll)和一个新的MiRabGDI基因的全长cDNA,对其表达模式和功能进行了初步研究,主要研究结果如下：1.根据前期已获得的MiRabll基因部分片段,采用RT-PCR结合5’RACE技术,从“四季杧”混合组织材料(叶、茎、花和果实)中克隆了一个杧果MiRabll基因cDNA全长,其序列长为902bp,包含完整开放阅读框的657bp,编码218个氨基酸的推导蛋白,推测分子量大小23.97KD,理论等电点为5.52。经BLAST比对及蛋白质同源性分析,其具有Rabll亚家族的典型结构特征,将该基因命名为MiRab11(GenBank登录号：KF768564)。生物信息学分析显示：该推导蛋白为亲水的中性蛋白质,定位于线粒体；同源性分析表明,杧果MiRabll与葡萄、柑橘和番茄具有较高的同源性。实时定量PCR结果表明：MiRabll基因在四季杧不同时期的叶、茎、花和果实中均有表达,其中在嫩茎和嫩叶中的表达量较高；在果实生长发育初期表达量略有下调,但在果实成熟过程中呈明显上调表达趋势；在不同逆境胁迫(低温、盐和干旱)处理后可诱导该基因上调表达；在不同信号物质(脱落酸、水杨酸和双氧水)刺激下,均可引起该基因的表达上调。2.根据MiRabll基因序列和结构域特征,采用重叠PCR定点突变技术,获得了两个结构域激活型突变体WiRabllCA和失活型突变体MiRabllDNo将MiRabll基因及突变体构建到原核pET-30a表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后可诱导其重组蛋白表达。SDS-PAGE结果显示,在28℃条件下,用0.5mmol·L-1IPTG诱导4h,可获得大量可溶性重组蛋白。将可溶性蛋白经Ni-NTA argrose层析柱纯化后,经SDS-PAGE和Western blot证实,上述重组蛋白均可与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性结合反应。转化子pET-MiRabll大肠杆菌经蛋白诱导表达后,对低温、高温和高盐耐受性显著提高。激活型突变体pET-MiRabllCA对低温、高温和高盐耐受性略有提高。3.克隆了一个杧果Rab5基因cDNA全长,其序列长为984bp,包含完整开放阅读框的603bp,编码200个氨基酸的推导蛋白,预测蛋白分子量为21.83KD,理论等电点为6.99。经BLAST比对及蛋白质同源性分析,其具有Rab5亚家族的典型结构特征,将该基因命名为MiRab5(GenBank,登录号：KF768563)。同源性分析表明,其与番茄的相似度最高为91%。实时定量PCR结果显示：MiRab5基因在四季杧不同阶段的叶、茎、花和果实中均有表达,其中在嫩叶和嫩茎中表达量最高；但在果实生长发育初期表达量呈下降趋势,在果实成熟过程中表达量增加,呈明显上调表达趋势；在不同逆境胁迫(低温、盐和干旱)处理后可诱导该基因上调表达；在不同信号物质(脱落酸、水杨酸和双氧水)刺激下,除水杨酸出现下调表达外,脱落酸和双氧水均可引起该基因不同程度的上调表达。采用重叠PCR定点突变技术,获得了两个结构域突变体Mi-Rab5CA和Mi-Rab5DN。将该基因及其突变体构建到原核表达载体pET-30a上获得融合重组表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3),可诱导产生大量可溶性重组蛋白。纯化后,经SDS-PAGE和Western blot证实,上述重组蛋白均可与抗6-His标签鼠单克隆抗体发生特异性结合反应。转化子pET-MiRab5大肠杆菌经蛋白诱导表达后,对低温、高温和高盐耐受性显著提高。但激活型突变体pET-MiRab5CA对低温、高温和高盐耐受性提高不大,失活型pET-MiRab5DN耐受性最差。4.克隆了一个杧果MiRab-GDI基因,其cDNA全长为1449bp,包含完整开放阅读框1335bp,编码444个氨基酸,预测蛋白分子量为49.75KD,理论等电点5.48。其推导蛋白具有GDI家族已知的典型结构和功能序列结构残基,与烟草Rab-GDI相似度最高为92%,命名为MiRab-GDI (GenBank登录号：KF768565)。实时定量PCR分析显示,该基因在四季杧不同阶段的叶、茎、花和果实中均有表达,其中在嫩茎和老茎中表达较高；在果实生长发育初期下调表达,但在果实成熟过程中上调表达；在不同逆境胁迫(低温、盐和干旱)处理后均出现不同程度的下调表达；在不同信号物质(脱落酸、水杨酸和双氧水)刺激下,可诱导该基因出现不同程度的上调表达。将该基因构建原核重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3),可诱导产生大量可溶性重组蛋白,该重组蛋白可与抗6-His标签鼠单克隆抗体发生特异性结合反应。转化子pET-MiRab-GDI大肠杆菌经蛋白诱导后,对低温、高温和高盐耐受性明显高于仅转化pET-30a的对照。5.将MiRabll基因及突变体、MiRab5基因及突变体和MiRab-GDI基因分别构建到植物双元表达载体pBI121上,转化拟南芥,并对转基因阳性植株进行了筛选,得到了7株转化苗(3株pBI-MiRab5,1株pBI-MiRab5CA>1株pBI-MiRab5DN>1株pBI-MiRabll和1株pBI-MiRabllCA)。T1代转基因拟南芥pBI-MiRab5、pBI-MiRab5CA和pBI-MiRab5DN植株在表型上存在较大差异,pBI-MiRab5DN生长势最好,激活型突变体pBI-MiRab5CA最差；T2代转基因pBI-MiRab5植株对低温和干旱适应能力强于激活型突变体pBI-MiRab5CA。总之,本研究从杧果中分离鉴定出2个Rab和一个Rob-GDI基因,初步功能分析表明：上述基因均参与低温、干旱和盐的信号转导过程；均能在果实生长发育初期或成熟过程中呈规律性的下调或上调表达；在不同逆境胁迫(低温、盐和干旱)和不同信号刺激物(脱落酸、水杨酸和双氧水)处理后均能诱导其基因的表达；上述基因及突变体均能在大肠杆菌中特异性表达重组蛋白。转化子pET-MiRab5、pET-MiRab11和pET-MiRab-GDI大肠杆菌对低温、高温和高盐耐受性明显提高；转基因MiRab5拟南芥过量表达可提高植株对低温和干旱的适应能力。研究结果表明,MiRab5、MiRabll和MiRab-GDI通过信号转导通路调控重要的生理活动,其功能除与逆境胁迫有关外,还可能与果实的发育和成熟有关。本研究为植物ABA的调控表达途径及信号转导提供了实验证据,有利于理解杧果响应逆境胁迫的分子机理和果实成熟机理,为进行杧果逆境遗传改良储备了候选基因资源。同时,对认识Rab类小G蛋白功能也起到一定的推动作用。