研究目的:即使在氧含量充足的条件下肿瘤细胞也会选择通过有氧糖酵解而不是线粒体氧化磷酸化的方式提供能量。糖酵解能够通过供应充足的能量支持肿瘤细胞的快速增殖,同时糖酵解引起的细胞外酸化能抑制免疫细胞导致肿瘤细胞免疫逃避。ENO1作为糖酵解过程中催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇丙酮酸的一种关键酶,它在人类多种类型的肿瘤中过度表达,并促进糖酵解增强和肿瘤生长,被认为是一种潜在的肿瘤生物标志物和治疗靶点。尽管在许多肿瘤中ENO1均有报道,但它在胰腺癌葡萄糖异常代谢中的功能机制尚未有详尽研究。本课题的研究目的是验证敲除ENO1后对胰腺癌细胞生物学功能的影响,并对其在胰腺癌细胞葡萄糖代谢中的作用机制做进一步探究,寻找ENO1在胰腺癌细胞异常代谢中的调控通路。这对研究胰腺癌发病机制,寻找更为有效的调控靶点都具有一定意义。研究方法:我们基于CRISPR-Cas9技术设计合成敲除ENO1的sgRNA序列,构建敲除ENO1的慢病毒表达载体,通过慢病毒包装感染和药物筛选后挑取单克隆细胞,以建立敲除ENO1的PANC-1和MIA PaCa-2稳定细胞系,Western Blot被用来验证敲除效果。之后我们使用CCK8试剂盒检测敲除ENO1后PANC-1和MIA PaCa-2稳定细胞系的吸光度变化来评估他们的增殖能力,并通过Transwell实验检测敲除ENO1后对胰腺癌细胞的迁移侵袭能力的影响,平板克隆实验则被用来检测敲除ENO1后胰腺癌细胞的克隆形成能力。接下来,我们通过细胞软琼脂克隆形成实验,让细胞在不贴壁及单细胞状态下模拟体内细胞所处的半固体状态,在体外检测敲除ENO1后胰腺癌细胞的增殖和成瘤能力变化。小鼠皮下成瘤实验进一步在体内检测敲除ENO1后对人类胰腺癌细胞成瘤能力的影响。此外,ENO1敲除组和对照组细胞的培养液被用来检测它们的葡萄糖消耗量和乳酸生成量,以此评估敲除ENO1后对胰腺癌细胞糖酵解水平的影响。完成这些生物学功能实验后,我们用ENO1敲除组和对照组胰腺癌细胞做转录组测序（RNA-seq）,对测序数据进行分析来筛选在胰腺癌细胞中敲除ENO1后的差异表达基因,并从中随机挑选几个基因通过qRT-PCR检测其mRNA表达水平的变化,以验证测序结果的可靠性。随后我们对这些差异表达基因进行GO富集分析以研究这些基因的主要功能和参与的生物学过程,并通过KEGG通路分析寻找与细胞代谢相关的通路和这些通路所包含的差异表达基因,以进一步探究ENO1在胰腺癌细胞异常代谢中的作用机制。研究结果:通过Western Blot验证,我们成功建立了敲除ENO1的PANC-1和MIA PaCa-2稳定细胞系。在Transwell迁移侵袭实验中,我们观察到敲除ENO1后穿过基底膜的胰腺癌细胞数量显著低于对照组,迁移侵袭能力显著下降。CCK8检测细胞增殖结果也表明敲除ENO1后的胰腺癌细胞生长曲线平缓,细胞增殖被抑制。平板克隆实验则显示胰腺癌细胞敲除ENO1后克隆形成率显著低于对照组,通过软琼脂克隆实验在体外检测敲除ENO1后胰腺癌细胞的成瘤能力我们也发现ENO1敲除组细胞克隆形成数明显低于对照组。动物实验进一步验证了体外实验的结果,敲除ENO1的PANC-1和MIA Pa Ca-2细胞在小鼠皮下移植瘤模型中生成的肿瘤体积小,生长速度慢,体内成瘤能力被显著抑制。同时,我们也检测到ENO1敲除后胰腺癌细胞葡萄糖消耗量和乳酸产量都明显下降,提示敲除ENO1后的胰腺癌细胞糖酵解水平降低。通过转录组测序我们从敲除ENO1的细胞中共鉴定出727个差异表达基因,这些差异表达基因主要与细胞外基质和内质网内腔等组分相关,参与心脏发育和信号受体活性调控等方面的生物学过程,在功能方面主要与受体配体活性和受体调节剂活性有关。KEGG通路分析发现ENO1可能在磷酸戊糖途径,果糖和甘露糖代谢,氨基糖和核苷酸糖代谢等通路中发挥作用,敲除ENO1后会影响这些代谢通路中G6PD,ALDOC和UAP1等基因的表达。结论:在胰腺癌细胞中敲除ENO1抑制细胞增殖,迁移侵袭和肿瘤形成能力,并显著降低了细胞糖酵解水平。敲除ENO1可能通过影响胰腺癌细胞代谢通路中G6PD,ALDOC和UAP1等基因的表达水平抑制其成瘤能力。