株高是株型的重要组成部分,也是影响作物产量的重要基础性状。小麦和水稻半矮秆基因的应用是第一次“绿色革命”成功的关键。半矮秆基因的利用显著降低了水稻和小麦植株的高度,增强了植株的倒伏抗性、耐肥性,同时还提高了收获指数,从而显著地增加了水稻和小麦的产量。油菜是我国重要的油料作物之一,现有的油菜品种植株高大,易因倒伏而导致产量降低、品质下降。油菜矮秆突变体较少,对油菜株型调控的分子机理研究有限。因此,筛选矮秆突变体,克隆相关基因,阐明油菜株高的形成机制,对于油菜的矮化育种具有重要意义。本研究以甘蓝型油菜(Brassica napus,AACC,2n=38)矮秆突变体ds-3为材料,对株高基因DS-3进行了遗传定位,并最终克隆了控制矮秆性状的矮秆基因ds-3,该基因编码赤霉素(GA)信号转导抑制因子DELLA蛋白,命名为Bna C07.rga-ds。本研究还对Bna C07.rga-ds及其同源基因进行了功能分析。此外,本研究对油菜矮秆突变体ds-4的矮秆基因进行了精细定位。主要结果如下:1.矮秆基因DS-3的定位、克隆以及功能验证突变体ds-3苗期叶片暗绿,植株匍匐生长。成熟期,植株株高及其各构成因子:第一分枝高度,节间数目,节间长度以及主花序长度均显著降低。此外,ds-3下胚轴的伸长对外源GA3处理的敏感性减弱。F1杂种的株高介于ds-3与野生型“华双5号”之间;BC1和F2群体株高分离比分别符合1:1和1:2:1的预期值,表明矮秆性状受单个不完全显性基因控制。BSA分析将目标基因DS-3定位在C07染色体两个SSR标记(Bo GMS4033和Bo GMS4044)之间,两个标记之间的遗传距离为6 c M。DS-3基因一侧4个连锁的SSR标记对应的C07染色体区段与A06染色体上株高基因Bna A06.RGA区段存在很好的共线性。在C07染色体目标区间内,存在与Bna A06.RGA同源的Bna C07.RGA,因此后续研究中将Bna C07.RGA作为DS-3的候选基因。比较测序发现,突变体ds-3的Bna C07.rga-ds基因编码区第272位核苷酸发生了C?T突变,该突变导致DELLA蛋白N端保守结构域VHYNP的脯氨酸(P)被替换成亮氨酸(L)。位点特异性标记分析结果表明,该点突变与F2和BC1群体株高共分离。在拟南芥中分别表达Bna C07.RGA和Bna C07.rga-ds,Bna C07.RGA的转基因植株株高与野生型没有显著差异,而Bna C07.rga-ds能显著降低植株高度。酵母双杂交试验结果显示:GA能介导Bna C07.RGA与受体GID1a的结合,但不能介导Bna C07.rga-ds与GID1a的互作。2.甘蓝型油菜RGA的拷贝数、进化分析及功能鉴定以拟南芥At RGA的氨基酸序列,进行双向BLASTp比对,在白菜、甘蓝以及甘蓝型油菜基因组中分别鉴定到2个Bra RGA基因,2个Bol RGA基因以及4个Bna RGA基因。基于核苷酸序列的进化树以及氨基酸序列一致性的分析结果均发现,油菜的4个Bna RGA基因来源于白菜的2个Bra RGA基因以及甘蓝的2个Bol RGA基因,构成4个直系同源基因对;RT-PCR分析发现,ds-3的4个Bna RGAs基因在茎秆与叶片中均有表达;GA处理能增强Bna RGA基因表达,但其响应GA的模式不尽相同。酵母双杂交试验结果发现,GA能介导各Bna RGA蛋白与GID1a互作。此外,通过比较ds-1与ds-3两矮秆突变位点对株高的影响发现,DS-3(Bna C07.RGA)对茎秆伸长的调控力要弱于DS-1(Bna A06.RGA)。3.矮秆基因DS-4的精细定位矮秆突变体ds-4幼苗期叶片皱缩、向下卷曲,植株匍匐生长,成熟期植株矮小。此外,ds-4的种子萌发率较低,下胚轴变短明显,开花前期茎顶端表现出轻微的正向地性,但暗形态建成表现正常。将矮秆突变体ds-4和野生型ZY821杂交,比较发现,F1的株高远低于中亲值,更接近矮秆亲本ds-4;F2和BC1群体植株可以明显地划为矮秆类型和正常类型,而且矮秆类型和正常类型的分离比分别符合3:1和1:1。BSA分析将目标基因DS-4定位于油菜C05染色体介于In Del标记ID-147与ID-162之间25.6 c M的区间内。随后,基于双亲重测序的数据在目标区间开发了4个连锁的CAPS标记,利用这些标记从F2群体高秆表型的植株中筛选交换单株,进而将DS-4定位在SNP2CAPS-1和SNP2CAPS-4之间4.1 M的物理区间。随后,在目标区间内开发了多个SNP标记,利用SNPseq?分型技术筛选BC1F2分离群体中在SNP2CAPS-4和SNP2CAPS-39之间的交换单株。最终,将DS-4锁定在SNP32和SNP40之间,对应于甘蓝型油菜“Darmor-bzh”基因组C05染色体上约为475 kb的区间内。