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目的:本研究通过对BALB/c雄性小鼠的不同干预,建立模拟人体生精功能损伤的动物模型,采用琼脂糖凝胶法对模型鼠睾丸组织体外培养,探索不同病理睾丸组织体外培养过程中的生精功能重建能力,为人类生精功能障碍体外培养研究提供依据。方法:1.采用单次腹腔注射不同浓度(30 mg/kg、40 mg/kg)的白消安建立不同损伤程度的生精功能障碍模型。2.采用琼脂糖凝胶法培养新生BALB/c雄性小鼠睾丸组织块,验证适于睾丸组织体外培养的体系。3.唯支持细胞型(SCOS)、生精阻滞型(H-S1、H-S2)生精障碍睾丸组织块的体外培养。4.冷冻-复苏的新生小鼠睾丸组织体外培养,探寻冷冻后睾丸组织体外成熟的能力。5.采用免疫组织化学技术检测培养前、培养过程中、培养后睾丸组织中减数分裂标记蛋白的表达情况,分别包括减数分裂前(STRA8)、减数分裂中(SCP3)、减数分裂后(TNP1)三个指标。6.采用TUNEL凋亡法检测睾丸组织体外培养前、培养后生殖细胞的凋亡情况。结果:1.8周龄BALB/c雄性小鼠单次腹腔注射不同浓度的白消安后,均对小鼠睾丸组织的生精功能造成损伤,且40 mg/kg浓度组在注射白消安后4周生精小管呈唯支持细胞型损伤。根据Johnsen评分标准,40 mg/kg浓度组在注射白消安后4~8周评分分别为2.66±1.30、3.24±1.04、3.54±1.27,与0 mg/kg组相比,有统计学意义(P<0.05)。2.琼脂糖凝胶法培养新生小鼠睾丸组织:培养前,新生小鼠睾丸组织生精小管间连接疏松,管腔内细胞排列规则、但种类单一、仅在近基底侧可见精原细胞,STRA8阳性细胞平均光密度值为0.4148±0.0047,细胞凋亡平均光密度值为0.0065±0.0006。培养过程中,与培养前对比,STRA8、SCP3、TNP1平均光密度值动态变化,在培养至4周时STRA8、SCP3最小(P<0.05),培养至7周时TNP1表达最小(P<0.05)。培养后,与培养前相比,生精小管连接紧密,管腔内细胞种类增加,有TNP1阳性细胞表达,细胞凋亡增加(0.0107±0.0012)。3.不同程度生精障碍睾丸组织体外培养:培养前,正常同周龄雄性小鼠睾丸组织生精小管连接紧密,管腔可见7~8层生精细胞规则排列;实验组生精小管萎缩,管腔空泡化,生精细胞种类缺乏;其减数分裂标记蛋白均明显低于正常对照组(P<0.05)。培养过程中,实验组中H-S2组培养效果最好,可见STRA8、SCP3平均光密度值呈上升趋势(P<0.05),TNP1极少数阳性表达,而SCOS组培养效果最差,无TNP1表达。培养后,与培养前相比,SCOS组TUNEL凋亡平均光密度值增加(0.0015±0.0001vs 0.0070±0.0003)。4.冷冻-复苏睾丸组织体外培养:培养前,冷冻-复苏组织与新鲜组织相比,生精小管组织结构破坏,细胞杂乱排列,STRA8阳性表达减小,细胞凋亡明显,其中尤以0.1M海藻糖的液氮熏蒸法凋亡最严重(0.4689±0.0126)(P<0.05)。培养48h后,实验组减数分裂标记蛋白与培养前相比均减小,细胞凋亡增加(P<0.05)。结论:1.成功建立唯支持细胞型、生精阻滞型生精障碍动物模型。2.琼脂糖凝胶法可以使新生小鼠睾丸组织块在体外培养过程中进入减数分裂。3.生精障碍睾丸组织体外培养后获得TNP1表达阳性的细胞,推测该培养体系可以诱导小鼠生精障碍睾丸组织体外精子发生。4.冷冻-复苏组织在体外培养过程中细胞凋亡严重,该培养体系仍需改进。