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细胞凋亡是一种进化上高度保守的细胞自杀形式。细胞凋亡的发生需要一个专门的蛋白质水解酶系统,即叫Caspase(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)的蛋白酶家族。Caspases通常以无活性的酶原形式存在于细胞中,在细胞凋亡信号刺激下,Caspases重新组装成含有两个大亚基和两个小亚基的成熟四聚体活性形式。活化的Caspases参与一系列蛋白质的降解作用,最终导致细胞的死亡。通常有两条主要途径激活Caspases:一条是通过细胞表面死亡受体途径,例如特异性配体结合的Fas等肿瘤坏死因子(TNF)家族,导致Caspase-8的激活,Caspase-8再依次激活下游的效应Caspase,如Caspase-3,-6,和-7；另一条是线粒体途径,细胞内细胞凋亡信号触发线粒体释放cytochrome c,随后cytochrome c与胞浆中的凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)结合,后者募集Caspase-9并诱导其加工和激活。线粒体外膜通透性的改变和cytochrome c的释放受Bcl-2家族蛋白质的调节,Bcl-2家族中促凋亡蛋白质分子Bax和Bak可做特定的蛋白质释放通道。细胞凋亡的失衡可引起肿瘤细胞的过度增殖以及其对抗癌药物的耐受,阐明细胞凋亡过程的分子机制,从而找到实施有效细胞凋亡方法,是治疗人类癌症的理想策略。桦木醇(Betulin,BT),是一种天然存在的五环三萜类化合物,大量存在于灌木树中,其含量高达桦树皮干重的30%。因为桦木醇具有多种药理学性质,故可做化学药物的前体化合物。目前,在结构上与桦木醇的衍生物桦木酸,被证实具有细胞毒性作用,对多种肿瘤细胞都显现出细胞毒性。最近研究报道了桦木醇也具有细胞毒性作用,但其抗肿瘤作用机制尚不清楚。本论文的研究目的是确定桦木醇是否具有癌细胞特异的毒性作用,并探讨其分子机制。在本论文的研究中我们得到了以下研究结果：1.桦木醇对多种癌细胞具有细胞毒性作用。桦木醇显著抑制人源宫颈癌细胞HeLa、人源肝癌细胞HepG2、人源肺癌细胞A549和人源乳腺癌细胞MCF-7的生存力,其IC50值在10-15μg/mL之间；对人源肝癌细胞SK-HEP-1、人源前列腺癌细胞PC-3和人源小肺癌细胞NCI-H460,桦木醇表现为中度的抑制活性,其IC50值在20-60μg/mL之间;但对人源白血病细胞K562显示出较弱的抑制活性,其IC50值大于100μg/mL。2.桦木醇诱导HeLa凋亡。我们选用人源宫颈癌细胞HeLa作为实验模型,对桦木醇抗癌细胞活性的分子机制进行研究。我们通过细胞形态学分析观察到：膜起泡、细胞核的凝缩和断裂以及凋亡小体的形成等典型的细胞凋亡现象。免疫印迹分析发现,桦木醇作用HeLa细胞8小时,细胞凋亡标志性蛋白质,Caspase-3的底物PARP出现断裂。3.桦木醇诱导HeLa细胞凋亡过程中Caspase-9和Caspase-3被激活,而Caspase-8不参与此细胞凋亡过程。桦木醇作用HeLa细胞4小时,起始Caspase-9的活力显著增加；8小时Caspase-3活力开始升高,12小时活力明显增强,在24小时达到顶峰；而整个凋亡过程中起始Caspase-8未被激活。4.桦木醇诱导HeLa细胞凋亡是线粒体cytochrome c和Smac的释放介导的。动力学分析显示桦木醇作用HeLa细胞30分钟,cytochrome c和Smac便释放到胞浆中,且释放量呈作用时间依赖性递增。线粒体膜电位的去极化发生在桦木醇作用HeLa细胞2小时,且随作用时间延长,去极化现象越发明显。5.桦木醇诱导HeLa细胞凋亡过程中Bax和Bak转位到线粒体上。Bax和Bak,是Bcl-2家族的促凋亡成员,被认为在细胞凋亡过程中线粒体膜上形成通道介导cytochrome c和Smac释放。当桦木醇作用HeLa细胞30分钟后,Bax和Bak迅速地转位到了线粒体上,且线粒体中的Bax和Bak水平呈作用时间依赖的方式逐步增加。6. SK-HEP-1细胞中Caspase-9的低表达可能是导致SK-HEP-1细胞对桦木醇耐受的主要原因。我们的研究发现Caspase-9在SK-HEP-1细胞中的表达水平明显低于其在HepG2细胞中的表达水平。当我们利用转染的方法将SK-HEP-1细胞中的Caspase-9表达水平恢复到与其在HepG2细胞中表达水平时,SK-HEP-1细胞对桦木醇的敏感性也达到与HepG2细胞相当的水平。总之,桦木醇对多种癌细胞具有特异的细胞毒性作用,能够在各类人源癌细胞中诱导线粒体介导的细胞凋亡,这一研究结果为研制副作用较小、疗效更好的抗肿瘤药物提供了前体化合物以及理论依据。