γ-聚谷氨酸(Poly(Y-glutamic acid)是由微生物合成的一种细胞外水溶性高分子氨基酸聚合物,由L-谷氨酸或D-谷氨酸的α-氨基和γ-羧基形成肽键缩合而成,是一种对人体和环境无毒害的可完全降解的生物相溶性新型天然高分子,用途广泛,在农业、化工、医药等领域都有良好的应用前景。目前,国内有关γ-PGA的研究大多处于实验室阶段,还没有实现大规模工业化生产。微生物发酵法生产γ-PGA的主要难题在于,菌株合成γ-PGA的代谢途径复杂,调节方式多样,提高菌株的发酵产率难度较大,从而使生产成本较高。故筛选高产菌种、降低生产成本是实现γ-PGA工业化生产的关键。本实验室前期筛选得到三株产γ-PGA的发酵菌株CC、DL和TW,本研究拟对三株菌进行分类鉴定,初步了解三株菌的遗传背景,并对三株菌的产物特性进行研究,为三株菌作为工业上发酵菌株的可行性提供实验依据。选择其中一株高产菌株DL,通过液体发酵和固态发酵两种方式对其进行发酵优化以进一步提高γ-PGA产量。同时,利用基因重组原理,尝试敲除菌株TW携带的降解酶基因,进而构建一株拥有良好特性的工业发酵菌。研究内容和结果概述如下：1.三株产聚谷氨酸菌CC、DL和TW的鉴定经形态学观察结合分子生物学方法：16S rRNA基因测序、核糖体分型技术及野生质粒序列同源性比对,将三株γ-聚谷氨酸的生产菌鉴定为枯草芽孢杆菌CC、DL和TW。产聚谷氨酸相关基因capBCAE及降解酶基因ywtD的序列测定与比对结果表明,三株菌与枯草芽孢杆菌的capBCAE基因同源性达到99.98%,三株菌均存在降解酶基因ywtD,同源性达到100%。2.三株产聚谷氨酸菌C、DL和TW的产物性质研究三株产聚谷氨酸菌的发酵周期、γ-PGA产量、分子量及结构均存在一定差异,菌株CC、DL和TW的发酵周期分别为48h、72h和60h,γ-PGA产量分别为25.81g/L、31.51g/L和25.80g/L,分子量分别为820kDa、700kDa和920kDa,菌株CC发酵周期最短,菌株DL的γ-PGA产量最高,菌株TW的γ-PGA分子量最大。三株产聚谷氨酸菌生产的γ-PGA均为D-L-混合型,但比例不同,来源于菌株CC的γ-PGA含有较高比例的L-谷氨酸。三者生产的γ-PGA均有较高絮凝活性,其中来源于菌株DL的γ-PGA絮凝活性可达到75.90%。3. Plackett-Burman设计与最陡爬坡实验优化菌株DL产γ-PGA发酵培养基通过Plackett-Burman设计优化菌株DL的发酵培养基,筛选出具有显著效应的3个影响因素,依次为谷氨酸钠、MgSO4·7H2O和NaCl。然后用最陡爬坡实验逼近最大产γ-PGA区域,所得最佳培养基组成为：麦芽糖6.25%,酵母粉1.25%,谷氨酸钠9%,NaCl3%,KH2PO40.625%,MgSO4·7H2O0.15%。优化后的γ-PGA产量可达81.56g/L,较优化前提高了158.8%。4.菌株DL产γ-PGA固态培养发酵优化考察了菌株DL以黄豆和豆粕粉为原料进行固态发酵的γ-PGA产量,实验结果表明,谷氨酸钠、葡萄糖以及辅料对γ-PGA的产率有明显影响,豆粕粉培养基中加入5%的谷氨酸钠时,γ-PGA的产率最高达到148.6g/kg,效果优于黄豆培养基。5.菌株TW的基因改造初探采用同源重组技术敲除菌株TW的降解酶ywtD基因。PCR扩增出长度分别为456bp和576bp的ywtD基因左右同源两臂,以卡那霉素抗性基因作为筛选标记,通过酶切、连接反应,转化入大肠杆菌DH5a,获得带有ywtD基因同源臂和抗性筛选标记的重组质粒pUC19-kan-ywtD-R-L,为将其转入菌株TW获得ywtd基因敲除的聚谷氨酸高产菌株打下基础。综上,本实验室筛选和鉴定得到三株高产聚谷氨酸枯草芽孢杆菌CC、DL和TW,三株菌发酵产γ-PGA的性质各有不同,为工业上不同要求的聚谷氨酸应用提供了新的高产发酵菌株,值得深入开发研究。其中菌株DL经液体发酵优化和固态发酵优化后产量达到国内较高水平,具有潜在的工业应用价值。