研究背景和目的吗啡、海洛因等毒品的非法使用产生的毒品成瘾已经成为席卷全球的社会公害,成瘾性强,戒断症状严重,复吸率高,根治困难。毒品成瘾是一种慢性复发性脑病,毒品成瘾机理十分复杂,涉及中枢神经系统的许多脑区。随着药理学、神经解剖学和神经生物学等学科的发展,目前发现脑内有一个对毒品的使用产生奖赏效应的系统,涉及多巴胺(DA)、阿片肽、γ-氨基丁酸(GABA)能系统三个主要的调控毒品成瘾的神经机制。吗啡、海洛因等毒品使用后,可以直接作用于阿片肽神经元,使其释放的内啡肽增加,内啡肽再作用于多巴胺神经元上的阿片受体,促发多巴胺神经元的活性而发挥药物奖赏效应；阿片肽神经环路与多巴胺神经环路还存在着大量的交互作用,共同对毒品的成瘾起增强作用；也有人认为吗啡等毒品可以直接作用于中脑-边缘系统多巴胺神经通路和中脑-边缘系统-皮质系统多巴胺神经通路中的多巴胺能神经元,导致多巴胺释放增加,多巴胺通过作用于脑内多巴胺D1、D2受体而完成奖赏效应,产生毒品成瘾作用；另外吗啡还可以通过GABA能神经元上的μ阿片受体的介导,抑制GABA能神经元,解除GABA能神经元对VTA内的多巴胺神经元的抑制,使得多巴胺神经元的活性增加,从而产生吗啡的间接药物强化效应。近年来,随着对药物依赖形成的神经解剖学、神经药理学及神经生物学机制的广泛深入研究,发现伏隔核在参与药物依赖的众多神经核(团)中起着关键作用。较多的动物实验及解剖学研究表明,伏隔核与药物成瘾关系密切,毁损双侧伏隔核会抑制大鼠海洛因自我给药行为的建立,能够消除成瘾大鼠的觅药行为,可以抑制吗啡诱导的复燃。我们推测海洛因成瘾与伏隔核中μ和δ阿片受体间的蛋白-蛋白相互作用有重要关系。该推论的依据是：(1)基因敲除μ或δ受体,尤其是μ基因敲除的小鼠对于海洛因不能引起条件性位置偏爱效应、运动增多等表现,鼠失去海洛因奖赏效应,不出现成瘾性；(2)在体外培养的细胞中,已有多种方法证明共表达的μ和δ受体形成受体复合物,从而交互影响各自的配体结合、受体向胞内运动和细胞内信号传导；(3)μ和δ受体不仅共存于相同的感觉神经元,而且还共存于伏隔核内相同神经元；(4)Schmidt BL等在大鼠活体实验中,进行了伏隔核内选择性受体激动剂注射,发现DAMGO联合DPDPE(分别是μ、δ受体激动剂)注射,具有明显的镇痛效应,而单一注射则效应明显降低。这些结果提示μ和δ受体激动剂的镇痛效应需要μ和δ受体的共同活化,支持伏隔核内μ、δ受体以复合物形式存在的观点。(5)立体定向伏隔核毁损对实验动物和海洛因成瘾患者均取得了较好的戒毒效果。Ji SP等首次证明特异性干扰肽能通过打断抑癌酶PTEN和5-HT2C受体间的蛋白-蛋白连接来阻断大麻奖赏效应。大鼠全身注射或向VTA直接注射Tat-3L4F干扰肽(Tat为源于HIV病毒分子启动子的11个氨基酸肽,3L4F为抑癌酶PTEN的第三胞内环的某一区段,Tat肽可携带3L4F穿过血脑屏障)能够显著抑制由大麻诱导的VTA多巴胺能神经元激活,可阻断由大麻或尼古丁诱导的条件性位置偏爱效应,并未产生常用阻断剂Ro600175容易引起的产生焦虑、阴茎勃起、进食减少和运动功能抑制等副作用。如果能找到μ和δ受体之间相互作用的特异性多肽序列,可能也能有效的打断μ和δ受体之间的相互作用,从而对海洛因成瘾起到阻断作用。使用药物脱毒后心理依赖不易消除,患者屡次复吸,海洛因脱毒后一个月内的复吸率达80%-85%,半年内的复吸率达95%,半年以上的复吸率高达97%,很多患者陷入“戒断-复吸-戒断”的恶性循环当中。寻找更有效的毒品成瘾治疗方法具有重要的意义。本课题研究就是基于这种需要,结合我们的推论,构建阿片受体μ、δ、κ的真核表达质粒,表达鉴定后,进行了免疫共沉淀研究,并采用GST pull down技术进行了μ和δ受体相互作用的domain区的寻找。实验方法和结果1、构建了大鼠的μ、δ、κ阿片受体的真核表达载体：本研究采用反转录巢式PCR方法,提取伏隔核为主的脑组织总RNA,随机引物逆转录为cDNA,通过外侧及内侧引物两次扩增,从大鼠脑组织总RNA中扩增出μ、δ、κ阿片受体cDNA基因,通过AT克隆,将目的基因构建到pMD20-T Vector中,测序鉴定均存在单点突变,使用Stratagene的定点突变试剂盒纠正点突变；然后再设计相应的引物,使用高保真酶,通过PCR扩增在μ、δ、κ阿片受体基因的C端分别引入蛋白抗原表位标签Myc、FLAG、HA,获得目的基因μMyc、δFLAG、κHA,AT克隆到pMD20-T Vector中,测序鉴定正确后,通过双酶切含目的基因(μMyc、δFLAG、κHA)的T载体及目的质粒pIRES2-EGFP,割胶回收,酶切片段连接,转化大肠杆菌,菌落PCR及酶切鉴定,最后测序确认,成功构建了如下三种阿片受体真核表达载体：μ-Myc-pIRES2-EGFP、δ-FLAG-pIRES2-EGFP、κ-HA-pIRES2-EGFP。2、μ-Myc-pIRES2-EGFP、δ-FLAG-pIRES2-EGFP、κ-HA-pIRES2-EGFP在HEK293中的表达及鉴定：将质粒μ-Myc-pIRES2-EGFP、δ-FLAG-pIRES2-EGFP、κ-HA-pIRES2-EGFP转染到HEK293细胞中,荧光显微镜下观察到表达绿色荧光蛋白的HEK293细胞比例高,提示转染效率较高。使用细胞免疫荧光和蛋白印迹也分别证明转染了相应质粒的HEK293细胞中,目的基因μ、δ、κ获得了高效表达。其中μ和δ阿片受体分别使用了标签抗体Myc一抗、FLAG一抗和μ一抗、δ一抗进行鉴定,结果显示构建的质粒在HEK293中表达的目的蛋白μ-Myc、δ-FLAG很好的保持了抗原抗体的结合特性。Western blot分析结果提示三种阿片受体(μ、δ、κ)主要以糖基化的二聚体(分子量约为140kD)形式存在,同时也存在少量的糖基化的单体蛋白(分子量约为85 kD)和存在少量未糖基化的单体蛋白(分子量约为45 kD),而且形成的同源二聚体的作用力较强,可以有效的抵抗SDS的作用,在SDS存在下和100℃高温的处理下仍能保持二聚体形态。3、μ和δ阿片受体的免疫共沉淀研究：我们在体外培养的HEK293细胞中,采用免疫共沉淀技术对μ和δ受体的相互作用进行了研究。将δ-FLAG-pIRES2-EGFP、μ-Myc-pIRES2-EGFP共转染到HEK293细胞,用Lysis buffer (Tris pH 7.4,50mmol/L,NaCl 120mmol/L,Triton-X100 1%,蛋白酶抑制剂混合物临用前加入)提取蛋白,采用免疫共沉淀技术(使用Myc一抗进行免疫沉淀,FLAG一抗进行检测；反过来用FLAG一抗进行免疫沉淀,Myc一抗进行检测)验证μ和δ受体之间的相互作用。免疫共沉淀结果显示使用Myc一抗(针对μ阿片受体)可以沉淀δ阿片受体,而使用FLAG一抗(针对δ阿片受体)可以沉淀μ阿片受体,Western blot的结果显示被沉淀下来的μ或是δ阿片受体均存在三种形式：同源二聚体形式、糖基化单体及未糖基化的单体形式。免疫共沉淀出现μ、δ的二聚体形式,提示μ和δ阿片受体的相互作用有部分发生在多聚体水平,即μ、δ各自以二聚体的形式再参与μ和δ受体的相互作用,而这种异源多聚体的μ、δ之间相互作用力比较弱,不能对抗SDS和高温的处理,经过SDS和100℃高温处理后,分离为各自的同源二聚体等形式存在。免疫共沉淀的结果出现未糖基化的受体单体杂交带,这也提示μ和δ受体间发生相互作用可能不一定需要受体糖基化。将μ-Myc-pIRES2-EGFP和δ-FLAG-pIRES2-EGFP分别转染HEK293细胞,单独表达后提取细胞裂解液,混合孵育后,未见到免疫共沉淀现象发生,这提示免疫共沉淀实验结果是特异的,μ和δ阿片受体的相互作用需要两者共表达为前提,这提示μ和δ阿片受体发生相互作用需要细胞内的加工环境或是需要其他第三者参与,μ、δ阿片受体单独表达后再混合并不能产生免疫共沉淀。4、μ与δ阿片受体相互作用的具体domain的pull down研究：分析δ阿片受体的分子结构拓扑图,使用原核表达质粒pGEX2TK,设计相应的引物,PCR扩增相应domain,与pGEX2TK质粒通过EcoR I和BamH I酶切位点进行链接,分别构建了δ受体的第二胞内环Ⅱ、第三胞内环Ⅲ、C末端、第一跨膜区TM1、第三跨膜区TM3、第五跨膜区TM5、第六跨膜区TM6及带FLAG标签的δ全长的GST融合蛋白的表达质粒pGEX2TK,相应的质粒分别为δⅡ-pGEX2TK、δⅢ-pGEX2TK、δC-pGEX2TK、δTM1-pGEX2TK、δTM3-pGEX2TKδTM5-pGEX2TK、δTM6-pGEX2TK、δ-FLAG-pGEX2TK。δⅡ-pGEX2TK、δⅢ-pGEX2TK、δC-pGEX2TK在BL21(DE3)菌株经IPTG诱导后实现了有效表达,采用Glutathione Sepharose 4B的batch purification方法,纯化相应的GST融合蛋白,然后与带Myc标签的μ受体蛋白孵育,离心洗涤沉淀后,进行蛋白印记,Myc一抗检测。第二胞内环Ⅱ、第三胞内环Ⅲ、C末端表达成功,pull down实验表明它们不在μ和δ受体相互作用中发挥重要作用。δTM1-pGEX2TK、δTM3-pGEX2TK、δTM5-pGEX2TK、δTM6-pGEX2TK、δ-FLAG-pGEX2TK分别采用了不同的IPTG诱导浓度(0.05、0.2、0.5、1、2mmol/L)、诱导温度(37、30、25℃)、诱导时间(4、7、16h)及不同的菌株(BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、Rosetta gami (DE3)、Rosetta (DE3))进行了大量表达诱导尝试。收集的细菌裂解液经SDS-PAGE电泳后,考马斯亮蓝染色鉴定,结果显示第三跨膜区和第五跨膜区获得了低浓度的表达,其他均未见到目的条带出现。第三跨膜区TM3、第五跨膜区TM5的GST-pull down结果也是阴性,显示它们也不是δ受体和μ受体的相互作用的主要domain。将TM1和δ-FLAG克隆到pET41a质粒,在BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、Rosetta gami(DE3)、Rosetta(DE3)菌株中也未见目的蛋白的表达。这一结果提示膜蛋白和疏水性的跨膜区在原核表达系统中表达存在相当大的困难。结论1、通过巢式PCR等技术成功构建了经典阿片受体μ、δ、κ的真核表达质粒,并在HEK293细胞中进行了表达鉴定。三种经典阿片受体在体外培养的HEK293中,主要以同源二聚体的形式存在。2、膜蛋白和疏水性的跨膜区在原核表达系统中表达存在相当大的困难。3、免疫共沉淀的结果提示μ和δ阿片受体的相互作用是特异的,需要以共表达为前提。两者的相互作用可以发生于同源二聚体、糖基化单体及未糖基化的单体的水平。4、δ阿片受体的第二胞内环、第三胞内环及C末端可能不是μ和δ阿片受体相互作用的主要domain。5、免疫共沉淀阳性而pull down阴性,提示μ和δ受体间的连接不排除通过其他蛋白介导的可能,即μ和δ之间的连接可能需要第三者介入,而不是普遍认为μ和δ阿片受体之间的直接作用。本实验创新之处1、通过巢式PCR扩增等,构建了μ-Myc-pIRES2-EGFP、δ-FLAG-pIRES2-EGFP、κ-HA-pIRES2-EGFP,pIRES2-EGFP表达质粒的使用及相应抗原表位标签的引入,可以方便转染效率观察和目的蛋白表达鉴定。2、免疫共沉淀结果提示μ和δ阿片受体的相互作用可以发生在多聚体的水平,而不单是异源二聚体水平。3、GST pull down结果提示μ和δ受体间的连接不排除通过其他蛋白介导的可能,即μ和δ之间的连接可能需要第三者介入,而不是普遍认为μ和δ阿片受体之间的直接作用。