研究背景：胶质母细胞瘤是中枢神经系统中常见的呈进展性的恶性肿瘤,也是人类死亡率最高的肿瘤之一。根据2007年世界卫生组织的分类标准,胶质母细胞瘤被分为四种病理亚型(Ⅰ-Ⅳ)。多形性胶质母细胞瘤(GBM, WHO Ⅳ)是目前公认的恶性程度最高、预后最差的原发性中枢神经系统肿瘤。尽管过去多年对此类的肿瘤的治疗策略发生了很大的变化,多形性胶质母细胞瘤的侵袭性的特性决定了肿瘤的治疗仍然是以手术切除为基础,辅以其他治疗方法以延长患者的存活期。在其他肿瘤患者中放疗能延长患者的存活期,甚至能治愈肿瘤,而放疗辅以化疗较单纯的放疗能延长患者的存活期。在近期的一项随机研究中,放疗辅以替莫唑胺化疗使得多形性胶质母细胞瘤的无进展存活期以及总存活期显著延长,从平均12.1个月延长至14.6个月。替莫唑胺作为一种口服的化疗药物,其副作用较小,通过增加肿瘤对放了的敏感性,已经成为胶质母细胞瘤的标准治疗方案。然而替莫唑胺对患者的存活期的影响、肿瘤的复发以及肿瘤对替莫唑胺的耐药仍然是巨大的挑战。尽管放疗辅以替莫唑胺化疗方案能延长多形性胶质母细胞瘤患者总的存活期,但是手术不能完全切除肿瘤以及肿瘤细胞对放疗得抵抗及对替莫唑胺的耐药仍然使得几乎所有的多形性胶质母细胞瘤患者治疗失败。有些多形性胶质母细胞瘤在首次确诊时就对替莫唑胺耐药,有些肿瘤在治疗的过程中逐渐对替莫唑胺产生耐药。因此对替莫唑胺耐药成了治疗多形性胶质母细胞瘤的一大难题。EZH2蛋白是由EZH2基因编码的一种蛋白质,目前研究证实其存在于染色体的7q35位置,包含20个外显子和19个内含子。EZH2蛋白属于多梳蛋白家族,形成多聚蛋白复合体以维持基因的转录抑制状态。以往的研究显示EZH2发挥转录抑制是通过直接控制DNA的甲基化水平来实现。除了存在于干细胞中,在正常细胞中EZH2的表达较低,难以被常规方法检测到或是处以表达抑制状态。与此相反,在前列腺癌、非小细胞肺癌、子宫内膜癌和肝癌等多种肿瘤细胞中能检测到EZH2的异常高表达,提示EZH2在肿瘤的发生、恶化进展中发挥重要作用。尽管EZH2在多种肿瘤的发生及恶化过程中的作用被广泛研究,但是其在肿瘤细胞对化疗药物的产生耐药中是否发挥作用以及如何发挥作用仍然不清。在本研究中,我们通过U251、U87以及对替莫唑耐药的U251、U87细胞系来研究EZH2在胶质母细胞瘤对替莫唑胺耐药中的机制。材料与方法细胞培养及转染人类胶质母细胞瘤细胞系U251及U87使用含10%胎牛血清、100IU每毫升青霉素、0.1mg每毫升链霉素的培养基(DMEM)在含5% CO2、37。C的环境中培养。在培养基中加入100μM的替莫唑胺连续2个星期来创建替莫唑胺的耐药株。每隔三天更换含有替莫唑胺的培养液,大部分的细胞死亡了,但是有小部分细胞存活并逐渐稳定传代,成功建立了替莫唑胺耐药的U251细胞株(U251/TMZ cells)及U87细胞株(U87/TMZ cells)。使用Lipofectamine 2000转染细胞,严格按操作说明(Invitrogen, Carlsbad,CA)执行。定量RT-PCR使用定量PCR来检验转录的相对水平。使用M-MLV逆转录酶加入提取的2ug大RNA。cDNA用来放大EZH2基因,β-actin基因用作内源性参照物。PCR的条件为：94℃ 4分钟,94℃ 1分钟40个循环,56℃ 1分钟,and 72℃ 1分钟。PCR 引物：EZH2 forward,5’-GCC AGA CTG GGA AGA AAT CTG-3’ reverse, 5’-TGT GCT GGA AAA TCC AAG TCA-3’;内源性参照物P-actin forward,5’-ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3’and reverse,5’-ATC TTC AAA CCT CAT GAT G-3’。MTT试验通过MTT试验来检测细胞活力。在96孔板上放置5x104细胞/孔,加入替莫唑胺(200 μg/ml)培养24,48,72,96和120小时。经过3天的培养,每孔加入20μl的MTT溶液(5 mg/ml;Sigma)培养4小时,然后移去MTT溶液,加入200μl二甲基亚砜(DMSO; Sigma)来溶解晶体。通过570nnm波长的光密度仪检测。免疫印迹试验培养的细胞裂解：裂解液RIPA(0.1% SDS,1% Triton X-100、1mM MgCl 2、10mM Tris-HCl,pH7.4)4℃ 30分钟,收集裂解液并离心,测定蛋白质浓度。全细胞裂解液(50μG)使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。将蛋白质转到硝酸纤维素膜上。非特异性结合位点使用5%脱脂奶粉TBST溶液(100mM Tris-HC1,pH值7.5,150 mM氯化钠,0.1%Tween 20)封闭,使用抗ezh2和抗GAPDH抗体室温孵育2小时。用TBST洗涤4次后,将膜用羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗孵育(西格玛奥德里奇,圣路易斯,MO)5%脱脂奶粉TBST溶液在室温下反应1小时；采用增强化学发光法显影(Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA)。SiRNA转染EZH2和siRNAs由上海吉玛制药合成(上海,中国)。抗EZH2靶序列及对照序列：5’-GAC UCU GAA UGC AGU UGC UTT-3’和5’-AGC A AC UGC AUU CAG AGU CTT-3’。细胞接种于6孔板中生长在含血清和无抗生素的培养基。转染细胞达到60%融合时,用脂质体2000(Invitrogen)根据制造商的说明进行转染。转染后4-6小时后细胞使用常规培养液冲洗,48小时后测试抑制的效率。流式细胞仪分析按上面描述的转染48小时后,收集细胞,PBS洗两次。洗过的细胞于0.6mlPBS重悬,用1.4毫升加100%乙醇溶液固定在4℃过夜。固定细胞用PBS洗两次,并用碘化丙啶(PI)溶液重悬,PBS溶液包括50 ug/mL的PI和50 ug/ml RNaseA (Sigma)没有钙和镁,并分别在37℃遮光孵育30分钟。染色后的细胞通过尼龙网筛除去细胞团块,用流式细胞仪和Cell Quest软件分析(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)。流式细胞仪重复分析3次。统计学分析数据使用均数±标准差(SD)表示,使用Students-Newman-Keuls方法比较,P<0.05认为有统计学意义。结果和母系U251及U87细胞系相比,EZH2在U251/TMZ和U87/TMZ中的表达增加。我们检测了U251/TMZ细胞、U87/TMZ细胞及母系U251及U87细胞系的生长活力。结果表明,与U251及U87相比U251/TMZ和U87/TMZ细胞约5倍耐TMZ。我们还检测了EZH2在胶质母细胞瘤细胞和TMZ诱导耐药细胞的蛋白表达。结果表明：在U251/TMZ和U87/TMZ细胞比在母系胶质母细胞瘤细胞EZH2的表达水平更高,提示EZH2可能与胶质母细胞瘤细胞的耐药机制有关。EZH2 siRNA能逆转U251/TMZ和U87/TMZ对替莫唑胺的耐药性。为了确定EZH2在胶质母细胞瘤对替莫唑胺耐药机制中是否起着关键的作用,我们将U251/TMZ和U87/TMZ细胞转染EZH2 siRNA和对照siRNA。转染的效率使用定量RT-PCR证实。Western blot结果表明EZH2 siRNA可有效降低EZH2蛋白水平。MTT试验显示敲除EZH2可以显著降低U251/TMZ和U87/TMZ细胞大约30-40%的活力,提示EZH2可能调节U251/TMZ和U87/TMZ细胞对替莫唑胺的耐药性。EZH2 siRNA转染的U251/TMZ和U87/TMZ细胞进入细胞凋亡。探讨细胞凋亡增加是否是因为在转染了EZH2 siRNA的U251/TMZ和U87 /TMZ细胞的生长抑制,使用Annexin V和PI双染色来观察细胞的凋亡。在转染了EZH2 siRNA的细胞中观察到了凋亡细胞的增加。EZH2 siRNA转染导致U251/TMZ和U87/TMZ的细胞周期阻滞在G1期。细胞周期进展延迟是抑制肿瘤细胞生长的另一个重要机制。通过U251/TMZ和U87/TMZ细胞来研究EZH2 siRNA对细胞周期分布的影响。流式细胞仪分析表明,G1期细胞的比例在抑制EZH2的细胞较对照组增加,提示EZH2的表达上调可促进U251/TMZ和U87/TMZ细胞的细胞周期进程。EZH2 siRNA处理可以降低MDR,MRP和BCRP的表达。肿瘤的多药耐药是针对肿瘤化疗方案能否成功的主要障碍。肿瘤细胞能够抵抗化疗药物的一个关键的机制在于增加ATP结合转运蛋白表达,包括P-糖蛋白(P-gp、MDR1)、多药耐药相关蛋白(MRP)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等。这些蛋白质发挥了对多种结构不同的化疗药物的能量依赖性的药物外排泵的作用,能够降低细胞内化疗药物蓄积。EZH2 siRNA转染后,我们通过定量RT-PCR和Western blot检测MDR,MRP和BCRP的mRNA和蛋白表达水平,结果表明抑制EZH2的表达水平可以降低MDR,MRP和BCRP的表达。讨论多形性胶质母细胞瘤是最常见的中枢神经系统原发性恶性脑肿瘤,其中位生存期约14个月左右。患者在手术切除肿瘤并取得病理诊断确诊后,于放疗的同时结合替莫唑胺化疗对于胶质母细胞瘤患者能增加其生存的时间,但是几乎所有的患者都因为肿瘤复发、病情恶化而死亡。肿瘤细胞的耐药是多个因素相互作用、共同发展的一个极为复杂的过程,对于原发性肿瘤和继发性肿瘤主要表现出对化疗药物的抵抗,即化疗药物不能完全杀灭肿瘤细胞。多形性胶质母细胞瘤对替莫唑胺产生耐药已经成为该疾病治疗中的一个严重的障碍。目前的研究显示MGMT、MMR酶活性、BER修复途径和药物外排泵被认为是胶质母细胞瘤患者对替莫唑胺产生耐药的最重要的机制。然而,这些机制仍然不能解释该现象所有的耐药机制。在这里,我们试图确定影响替莫唑胺对胶质母细胞瘤的疗效的一些非常规的因素。采用TMZ敏感和耐TMZ-胶质母细胞瘤细胞系的基因表达分析,我们发现在在胶质母细胞瘤细胞中沉默EZH2表达水平与TMZ耐药表型相关。果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)是多梳组成员(PCG)蛋白质。PeG蛋白是重要的表观遗传调节蛋白,可通过染色质修饰转录抑制沉默特定的基因。PcG蛋白组成的多梳抑制复合物(PRC)。其中PRC2包括增强EZH2、 SUZ12和EED。EZH2属于PRC2复合体的核心成员,目前研究显示其主要作用是使组蛋白的27位赖氨酸三甲基化来抑制特异基因的转录。近年来,越来越多的研究显示EZH2有促进肿瘤形成和进展的作用,包括影响细胞分化和增强肿瘤细胞的增殖和体内肿瘤的生长。EZH2在多种恶性肿瘤中呈过度表达,如卵巢癌、胰腺癌、肝癌等,且其过度表达状态与患者预后不良相关呈正相关。在我们的研究中,我们初步证实EZH2在对替莫唑胺耐药的人脑胶质母细胞瘤细胞U251/TMZ和U87/TMZ中呈高表达。因为EZH2在功能上属于甲基转移酶,过度表达的EZH2可以通过增加DNA组蛋白的甲基化来调控下游基因的转录。为了解释EZH2表达升高的机制,我们采用RNA干扰技术沉默EZH2的表达,发现EZH2 siRNA转染入肿瘤细胞后,能快速有效地沉默EZH2基因mRNA和蛋白水平,转染效率可达到70%以上,表明转染EZH2 siRNA有较好的抑制作用。为了计算细胞生长活力,通过MTT法检测EZH2和TMZ耐药细胞株U251/TMZ和U87／TMZ生长能力之间的关系。EZH2表达下调可显著降低U251/TMZ和U87细胞／TMZ 30-40%的细胞生长活力,提示EZH2可能具有调节细胞增殖的能力,这一结果与在乳腺癌和前列腺癌中的研究结果相一致。EZH2沉默后TMZ对U251/TMZ和U87/TMZ细胞杀伤力明显增强。细胞周期可用于评估肿瘤细胞对化疗的敏感性。我们分析了每一组的细胞周期分布,发现在对照组和转染si EZH2组,在G1期的细胞比例有逐渐增加的趋势,而在S,G2和M期细胞的比例则相应的出现降低,表明细胞周期在G1期发生阻滞。这一发现表明EZH2 siRNA处理可通过阻断从G1期向S期和G2期过渡从而抑制细胞周期的进展。这个发现和在结肠癌中发现的沉默EZH2能降低cyclin D1的表达,导致在细胞周期在G1/S期阻滞相一致。此外,在胰腺癌的研究中,沉默EZH2基因能增强p27Kip1的表达,从而抑制细胞周期G1/S期的过渡。在我们的实验中,我们发现与以前的报道是一致的。肿瘤细胞产生多药耐药的机制是非常复杂的过程,与基因、细胞因子和转运蛋白等因素密切相关。ATP结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)在以往的研究中被认为在多种肿瘤多药耐药性的发展中起着至关重要的作用。肿瘤患者一旦出现多药耐药,其不仅仅对正在服用的化疗药物产生抗药性,同时也对多种从未使用过且作用机制不同的化疗药物产生耐药。这是由几个因素造成的,其中一个是ABC转运蛋白发挥的增加药物从细胞内的排泄的作用。例如,ABCB1蛋白(P-gp)具有将抑制肿瘤药物泵出细胞的功能。P-gp亦称MDR1,ABCB1,是ABC转运蛋白的代表和研究最广泛的基因。P-gp已知具有运输有机阳离子或中性化合物的作用。另外一个ABCC家族成员,也被称为MRP,也被证明具有运输有机阴离子化合物出细胞的作用。ABCG家族研究最多的成员ABCG2,也称BCRP(乳腺癌耐药蛋白),具有抵抗大多数拓扑异构酶Ⅰ或Ⅱ抑制剂如拓扑替康、伊立替康、多柔比星的作用。我们的研究在基因和蛋白水平证实了这一结论。探讨对替莫唑胺耐药的胶质母细胞瘤细胞在EZH2被抑制后恢复了对化疗敏感性的机制,我们还检测了MDR,MRP和BCRP的表达,发现MDR, MRP和BCRP的表达在EZH2沉默后显著降低。如上所述,MDR,MRP和BCRP,属于ABC转运蛋白家族,作为药物泵能将化疗药物泵出肿瘤细胞。当MDR,MRP和BCRP表达上调时,药物外排泵可以减少化疗药物的细胞内浓度,从而降低TMZ的杀伤肿瘤细胞的作用。EZH2基因沉默能降低MDR,MRP和BCRP mRNA和蛋白水平,从而降低外排泵活性,能增加胶质母细胞瘤细胞的化疗敏感性。因此,EZH2介导的耐药作用可能通过MDR,MRP和BCRP来实现的。研究结论：我们的研究显示EZH2在多形性胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺产生耐药的过程中所发挥关键的作用,研究结果表明抑制EZH2能逆转胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺的耐药状态,EZH2介导的耐药作用可能是通过增加MDR,MRP和BCRP等转运蛋白的表达来实现的。