论文部分内容阅读
目的:胃癌是最常见的癌症之一,尽管针对胃癌的诊断、治疗研究不断深入,但预后仍差,生存率仍低。研究显示,miRNAs参与了肿瘤的发生发展,针对miRNAs寻找肿瘤的有效治疗措施已成为当前肿瘤分子诊断治疗的重要研究方向之一。本研究目的在于探讨miR-433发生与胃癌发生发展的关系,揭示miR-433与JNK1相互作用与胃癌细胞生物学行为的关系,阐明miR-433通过JNK1抑制胃癌细胞增殖、凋亡及其迁移和侵袭中的作用与机制,为胃癌的分子病理学基础提供相关的实验资料,期望能够找到胃癌治疗的新靶点,为胃癌的治疗提供新的思路和策略。方法:首先,进行人正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)以及人BGC-823、MNK-28和MNK-45三种胃癌细胞株的培养,用TRIzol试剂盒提取总RNA,采用TaqMan MicroRNA检测方法进行qRT-PCR,检测在胃癌细胞系和的miR-433水平;生物信息学发现JNK1 mRNA含有miR-433潜在的结合位点;将人工合成的与miR-433作用的人JNK1基因的3’UTR端插入到萤火虫荧光素酶基因的下游,用双荧光素酶报告系统检测萤火虫荧光素酶和肾荧光素酶的活性;分别应用miR-433转染、miR-433和JNK1共转染至MNK-45,蛋白印记检测JNK1的蛋白表达。其次,将miR-433转染、miR-433和JNK1共转染至MNK-45后,CCK-8法检测细胞增殖,PI染色检测细胞周期,应用Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡,采用Western blotting方法检测凋亡相关因子Bcl-2、Bax、PCNA和Caspase-3的表达,观察miR-433通过JNK1对MNK-45细胞的增殖、细胞周期、细胞凋亡的作用。随后,常规方法进行细胞迁移和侵袭试验,采用Western blotting方法检测细胞迁移因子MMP-2、MMP-8的表达,观察miR-433通过JNK1对MNK-45细胞迁移和侵袭的作用。结果:研究结果首先发现,BGC-823、MNK-28和MNK-45三种胃癌细胞的miR-433表达水平均显著低于与正常人GES-1细胞;miR-433显著抑制含JNK1 3’UTR下游的荧光素酶活性,表明JNK1可能是miR-433在胃癌细胞中的靶向基因;miR-433基因转染能显著抑制MNK-45细胞的JNK1蛋白表达,该作用被miR-433和JNK1共转染废除。随后,结果显示,miR-433基因转染可明显抑制MNK-45细胞的增殖,诱导细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,抑制了PCNA蛋白表达,上调Caspase-3蛋白表达,提高了Bax/Bcl-2比值;miR-433和JNK1共转染则显著抑制了miR-433基因转染对MNK-45细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡的有利作用。最后,miR-433基因转染显著抑制了MNK-45细胞的迁移与侵袭能力,抑制了MMP-2和MMP-9的蛋白表达,同样地,这些作用被JNK1转染逆转。结论:胃癌细胞株miR-433表达下调,且与JNK1表达呈负相关;提高miR-433表达能够抑制胃癌MNK-45细胞的增殖,诱导细胞凋亡,从而降低侵袭和迁移能力;JNK1高表达可以解除miR-433过表达抑制胃癌MNK-45细胞增殖、诱导凋亡、降低迁移和侵袭的作用。总之,miR-433参与了胃癌的发生和进展过程,提高miR-433表达通过靶向JNK1发挥了促进细胞凋亡抑制胃癌细胞迁移与侵袭的生物学过程。miR-433成为胃癌的诊断和治疗的一个新的潜在靶点。