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有些革兰氏阴性细菌是食源性致病菌,其外膜大量分布的脂多糖(LPS)分子,俗称内毒素(Endotoxin),与其致病能力密切相关。因此,研究内毒素分子结构与其活性的关系对有效控制食源性革兰氏阴性致病菌有理论指导意义。Kdo2-lipid A是细菌维持正常生长所必备的最小LPS结构,也是LPS的活性基团,能激活哺乳动物先天性免疫系统。本论文通过敲除大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)染色体基因上与LPS合成相关基因,构建了五株能够直接合成新型特殊结构Kdo2-lipid A的突变菌株,并通过表型分析和细胞刺激实验探究了各菌株及其合成的Kdo2-lipid A活性。具体研究成果如下:(1)基于同源重组和位点特异性重组原理,分别敲除了实验室前期构建的E.coli出发菌株HW001、HW002、HW003、HW004和HW005染色体上的waa C-waa F基因簇,并去除抗性筛选标记与辅助质粒,构建五株新的突变菌株BW001、BW002、BW003、BW004和BW005;(2)通过SDS-PAGE、TLC、ESI/MS和ESI/MSMS等分析手段分别鉴定了E.coli突变菌株BW001、BW002、BW003、BW004和BW005所合成的LPS结构,发现五株突变菌株所合成的LPS菌缺失了多糖长链,变为结构特殊的Kdo2-lipid A;(3)通过用活菌体直接刺激HEK-Blue h TLR4细胞,发现五株突变菌株BW001、BW002、BW003、BW004和BW005的细胞激起TLR4信号通路的活性比野生型W3110和五株出发菌株均有所下降;(4)提取纯化BW001、BW002、BW003、BW004和BW005所合成的Kdo2-lipid A,刺激小鼠RAW264.7细胞及人THP-1细胞,通过ELISA实验分别测定小鼠和人类促炎性细胞因子的释放量。结果表明:BW001、BW002、BW003、BW004和BW005的Kdo2-lipid A样品比野生型W3110的LPS样品刺激细胞后促炎性细胞因子释放量有所降低,对细胞毒害作用明显减弱,其免疫活性与五株出发菌株LPS样品比较接近;(5)通过表型分析,发现BW001、BW002、BW003、BW004和BW005较外膜渗透性、抗生素敏感性、疏水性及自凝集能力比野生型和出发菌株高,但其菌膜形成能力和MIC值却比野生型和出发菌株低。本课题中E.coli突变株所合成的一系列特殊结构低毒内毒素分子具备进一步开发利用成为新型疫苗佐剂的潜力,突变株优良的生化表型特性也为菌株后续的工业化应用奠定基础。