论文部分内容阅读
目的：观察E.coli质粒表达重组人乙酰胆碱(human acetylcholine receptor, H-AChR)γ亚单位免疫诱导HLA-DQ8转基因小鼠眼肌型实验性自身免疫性重症肌无力(ocular experimental autoimmune myasthenia gravis, oEAMG)模型的建立并探讨oEAMG模型的特点,明确乙酰胆碱受体抗体(acetylcholine receptor antibody, AChR-Ab)在oEAMG发病机制中的作用和特点。方法：HLA-DQ8转基因小鼠27只,随机平均分成H-AChR γ亚单位免疫组,E. Coli.提取物免疫组,CFA免疫组,用乳化于CFA的重组H-AChR γ亚单位,或E. Coli提取物,或纯CFA分别于0,30,60天免疫。第二次免疫后,每周进行一次小鼠眼部和全身症状评估,小鼠肌肉握力测量,实验结束前进行小鼠前庭眼反射检测。第二次免疫后第15天和45天收集小鼠血清,RIA检测小鼠血清AChR-Ab水平,ELISA检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2b、IgG2c、IgM水平。结果：H-AChR γ亚单位免疫组9只小鼠中8只(89%)出现眼部症状,6只小鼠有完全上睑下垂症状,9只小鼠中6只(67%)小鼠出现轻度的全身症状(1级),而E. coli免疫组,CFA免疫组无明显眼部表现及全身肌力减退症状,H-AChR γ亚单位免疫组眼部及全身临床症状严重度评分明显高于其它两组(P均<0.001)；第二次免疫后35天起,H-AChR γ亚单位免疫组小鼠肌肉握力与E. coli免疫组,CFA免疫组两组比较具有显著性差异(P均<0.05),H-AChR γ亚单位免疫组小鼠肌肉握力在实验终止前降至最低；与E. coli免疫组,CFA免疫组两组相比,H-AChR γ亚单位免疫组小鼠水平维度的视动反应增益明显下降(P均<0.05)；第二次免疫后15,45天,H-AChRγ亚单位免疫组小鼠血清中AChR-Ab和抗-AChR Ig (IgM、IgG、Ig2b、Ig2c、 IgG1)水平均明显高于E. coli免疫组,CFA免疫组,差别有显著性(P均<0.001)。结论：重组H-AChR γ亚单位能成功诱导小鼠oEAMG模型,AChR-Ab在诱导oEAMG发生和发展的过程中发挥重要作用。目的：探讨重组H-AChRγ亚单位免疫诱导下oEAMG的免疫学发病机制。方法：HLA-DQ8转基因小鼠用乳化于CFA的重组H-AChRγ亚单位,或E. Coli提取物,或纯CFA分别免疫,免疫后第8天后,取淋巴结和脾淋巴细胞体外培养,3H-TdR掺入法检测淋巴细胞增殖反应,收集培养上清液用ELISA检测IL-2,IFN-γ,IL-6,IL-10水平。第3次免疫后30天,流式细胞仪观察各组小鼠脾脏和淋巴结中CD4+CD25+细胞和CD19+细胞百分比变化,免疫荧光法检测3组小鼠眼外肌(extraocular muscle, EOM)和后肢肢体肌(limb muscle, LM)神经肌肉结点处(neuromuscular junction, NMJ) IgG或补体沉积情况,RT-PCR法检H-AChRγ亚单位免疫组和CFA免疫组小鼠EOM和LM的AChR α, γ和ε亚单位mRNA转录水平的变化。结果：H-AChR γ亚单位免疫组小鼠淋巴结和脾淋巴细胞增殖反应显著高于E. Coli提取物或CFA免疫组(P均<0.05),ELISA显示H-AChR γ亚单位免疫组小鼠淋巴细胞体外培养上清液中IL-2, INF-γ水平显著均高于E. coli提取物和CFA免疫组(P<0.05),IL-6,IL-10水平与E. coli提取物和CFA免疫组相比均无显著差异(P均>0.05)。流式细胞结果显示,H-AChR γ亚单位免疫组小鼠淋巴结和脾脏中CD4+CD25+细胞和CD19+细胞百分比显著高于E. coli提取物和CFA免疫组(P均<0.05)。H-AChR γ亚单位免疫组小鼠EOM和LM NMJs处可见大量IgG, C3,和MAC沉积,而E. coli提取物和CFA免疫组小鼠NMJs未见IgG, C3,和MAC沉积(P均<0.001)。与CFA免疫组相比,H-AChR γ亚单位免疫组小鼠EOM和LM的AChR α, γ和ε亚单位mRNA转录水平显著增高,有统计学差异(P均<0.05)。结论：H-AChR γ亚单位免疫能诱导oEAMG和gEAMG的发生与发展,细胞免疫、体液免疫和补体等多种机制参与其发病。目的：观察H-AChR ε亚单位免疫原性在眼肌型重症肌无力发病机理中的作用,进一步探讨AChR亚单位诱导产生的自身免疫反应与oMG和oEAMG的关系。方法：通过PT-PCR检测HLA-DQ8转基因小鼠出生后0,1,2,4周EOM和LM的AChR α, γ和ε亚单位表达水平变化。HLA-DQ8转基因小鼠用乳化于CFA的重组H-AChR ε亚单位,或E. Coli提取物,或纯CFA分别于0,30,60天免疫,第二次免疫后每周进行一次小鼠眼部和全身症状评估,小鼠肌肉握力测量,第二次免疫后第45天收集小鼠血清,RIA检测小鼠血清中AChR-Ab水平,ELISA检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2b、IgG2c、IgM水平,第3次免疫后30天,免疫荧光法检测小鼠NMJ处IgG或补体沉积情况。结果：EOM的AChR α, γ和ε亚单位的mRNA转录水平随出生后时间的增加无明显改变(P均>0.05),在出生后第0周小鼠LM的中可见AChR γ亚单位的表达,无AChR ε亚单位的表达,出生后第1周LM中,AChR γ亚单位的表达消失,出现AChR ε亚单位的表达,而α亚单位表达无明显变化(P均>0.05)。H-AChR ε亚单位免疫组9只小鼠中3只(33%)有眼部症状,2只(22%)小鼠有轻度的全身症状(1级),而E.coti免疫组,CFA免疫组无明显眼部和全身改变,H-AChR ε亚单位免疫组眼部和全身临床症状严重度评分明显高于其它两组(P均<0.05)。H-AChR ε亚单位免疫组小鼠平均肌力与E-coli免疫组,CFA免疫组两组比较无显著性差异(P均>0.05)。第二次免疫后45天,H-AChR ε亚单位免疫组小鼠血清中AChR-Ab和抗-AChR Ig(IgM、IgG、Ig2b、Ig2c’IgG1)水平均明显高于E.coli免疫组、CFA免疫组(P均<0.01)。有明显眼部和全身症状的H-AChRε亚单位免疫组小鼠EOM和LM NMJs处可见大量IgG,C3,和MAC沉积,而E.coli提取物和CFA免疫组小鼠NMJs基本没有IgG,C3,和MAC沉积(P均<0.01)。结论：HLA-DQ8转基因小鼠对H-AChR ε亚单位免疫诱导的oEAMG的易感性低,可能与AChR ε亚单位与HLA-DQ8分子的交互作用所诱导的自身免疫应答反应较弱有关。