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蛹虫草作为重要食药用真菌,其很多功效都接近于冬虫夏草,具有提高人体免疫力、抗肿瘤和抗氧化等功能,是冬虫夏草的最佳替代品。目前,蛹虫草在我国已经实现人工大规模种植,但克服蛹虫草菌株易退化的特性一直是其工业化生产中无法突破的技术瓶颈。随着分子生物学的快速发展,基因工程、CRISPR基因编辑等新技术的兴起,将为蛹虫草功能基因挖掘、菌株退化机制探索及菌种定向改良等研究提供新的途径。本研究采用倒置显微镜、扫描电子显微镜观察蛹虫草退化菌株与正常菌株菌丝的形态特征,并且分别用高效液相色谱(HPLC)、BODIPY脂滴染色、荧光定量PCR测定蛹虫草退化菌株与正常菌株中腺苷与虫草素含量、脂质含量、细胞自噬相关基因的表达水平。结果表明,蛹虫草退化菌株的菌丝体分枝多、畸形,呈弯曲的不规则状;退化菌株的菌丝中腺苷含量比正常菌株的低30.23%,两者发酵液中的腺苷含量无差异,但在退化菌株的菌丝和发酵液中均未检测到虫草素;BODIPY染色后,退化菌株的荧光亮度明显低于正常菌株;细胞自噬相关基因Atg13、Atg18、Atg22、Atg22-2表达量在退化菌株中呈上升表达,退化菌株比正常菌株分别上升了432.19%、170.45%、336.06%、61.01%;而Atg17呈下调表达,退化菌株比正常菌株下调了65.28%,两者Atg28的表达量无差异。由此推测蛹虫草菌株在退化过程中发生了复杂的生理生化变化,同时其相关基因表达水平也发生了显著变化。因而建立成熟高效的蛹虫草基因编辑技术、进而探究蛹虫草相关基因功能,对进一步探索其菌株退化机制具有积极意义。使用农杆菌转化法分步转入Cas9基因与gRNA基因方法,对蛹虫草基因组中尿嘧啶合成基因URA5进行编辑,构建高效CRISPR/Cas基因组编辑系统。结果表明,通过该方法转入Cas9基因的蛹虫草底盘细胞在马铃薯培养基上生长良好,和野生菌株无异。在此基础上,在底盘细胞中以不同的三型启动子U6、5S-1、5S-2转录URA5为靶点的gRNA进行编辑效率的测试。结果表明,三种启动子都能获得在含5-FOA的培养基中生长良好的尿嘧啶缺陷菌株,其中U6启动子编辑效率最高,可高达100%。而5S-1启动子编辑效率为70%,5S-2启动子编辑效率仅达50%。因此,以U6为启动子的CRISPR/Cas基因组编辑系统,对蛹虫草相关基因的编辑效率最高。