目的:支气管肺发育不良（BPD）是全球范围内严重影响超低和极低出生体重儿死亡率及预后的慢性肺疾病。BPD的防治已成为新生儿领域的研究热点。肺泡发育停滞是BPD的主要病理特点,氧化应激反应是BPD肺泡发育停滞的关键致病机制。产前产后感染、难以避免的氧气吸入、机械通气等因素均可导致早产儿尚未发育成熟的肺组织发生氧化应激反应,导致肺发育顺序和方向异常,最终阻滞肺泡生长,严重影响早产儿肺功能。因此,深入探究氧化应激诱导肺泡发育停滞的分子调控网络,可为防治BPD提供重要的理论依据。Ⅱ型肺泡上皮细胞（ATII）是肺泡上皮细胞的“祖细胞”,也是BPD肺泡发育阻滞的关键靶细胞。国内外学者和本课题组前期工作已证实,氧化应激诱导ATII细胞凋亡异常增多是BPD肺泡发育停滞的重要致病机制之一。分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）通路是机体调节细胞应激最常被提及的信号通路。凋亡信号调节激酶1（ASK1）是MAPK家族的重要成员,ROS信号能激活ASK1,并通过级联酶促反应激活JNK和p38 MAPK,共同诱导细胞凋亡。ASK1-JNK/p38通路诱导细胞凋亡参与多种氧化应激相关疾病的发生,如急慢性肾脏疾病、心血管疾病、脑缺血再灌注损伤和肝硬化。多个研究证实,JNK和p38 MAPK在高氧肺损伤模型的细胞凋亡机制中承载核心作用。细胞间通讯在机体应对各种应激反应、掌握细胞命运中起到重要作用。机体为了应对急性或轻度应激,会迅速调动细胞间通讯网络,以多细胞整体来“稀释”受损细胞的毒性,有利于受损细胞存活（好心人效应）。但当应激严重或持续时,细胞间通讯网络则成为传播和放大细胞毒性的媒介,导致更多的细胞损伤甚至死亡（旁观者效应）。缝隙连接通道（GJCs）是一种跨细胞膜通道,是介导细胞间通讯的最常见形式之一。有研究证实,GJCs允许促凋亡信号在细胞间传递,诱导细胞凋亡增多,而GJCs阻断剂可抑制细胞间促凋亡信号的传递,进而维持细胞稳态,减少细胞凋亡。GJCs由缝隙连接蛋白（Cxs）组装而成,6个Cxs在细胞质膜上寡聚组成1个缝隙连接半通道（HCs）,相邻细胞质膜上的HCs两两对接构成GJCs。Cxs共有21种亚型,肺泡上皮细胞中表达的Cxs包括Cx26、Cx32、Cx43和Cx46,其中Cx43是肺泡上皮细胞间GJCs的主要构成者。基于以上,本研究首先在动物实验明确Cx26、Cx32、Cx43和Cx46在BPD大鼠肺组织的表达情况。其次,在动物实验中,探讨Cx43-GJCs阻断剂Gap26对对BPD大鼠肺泡发育结局的影响,对氧化应激反应及细胞凋亡水平的影响,对ASK1-JNK/p38通路的影响。最后,在ATII细胞实验中,探讨Cx43与氧化应激及细胞凋亡之间的潜在调控机制。研究方法:1.在体内实验,明确Cx26、Cx32、Cx43和Cx46在BPD新生大鼠肺组织的表达情况。（1）动物模型和分组:将新生SD大鼠于生后12小时内随机分为N组（常氧组）和H组（高氧组）,N组饲养于常氧环境（21%O2）,H组饲养于高氧环境（85%O2）,连续14天。（2）实验方法:通过对肺组织切片行HE染色和计数辐射状肺泡数（RAC）值观察肺组织病理改变及定量检测肺泡发育状况。通过ROS、MDA和GSH试剂盒分别检测肺组织ROS、MDA和GSH水平。通过TUNEL荧光染色及Western blot检测cleaved caspase-3/caspase-3蛋白相对表达评估肺组织细胞凋亡水平。通过免疫组化、免疫荧光双染检测Cx26、Cx32、Cx43和Cx46在肺泡中的表达情况。利用Real-time PCR检测Cx26、Cx32、Cx43和Cx46 mRNA表达水平。利用Western blot检测Cx26、Cx32、Cx43和Cx46在肺组织膜蛋白及总蛋白的表达水平。2.在体内实验,研究Cx43-GJCs阻断剂Gap26对肺泡发育的影响,对氧化应激、细胞凋亡及ASK1-JNK/p38信号通路活性的影响。（1）动物模型和药物干预:Gap26是Cx43模拟肽,与Cx43竞争性结合,阻止Cx43-GJCs形成,进而阻断Cx43-GJCs介导的细胞间通讯。将新生SD大鼠于生后12小时内随机分为4组,包括N组（常氧+盐水组）,N+Gap26组（常氧+Gap26组）,H组（高氧+盐水组）和H+Gap26组（高氧+Gap26组）。N组和N+Gap26组饲养于常氧环境（21%O2）,H组和H+Gap26组饲养于高氧环境（85%O2）,连续14天。N+Gap26组和H+Gap26组新生大鼠于生后12小时内腹腔注射Gap26,浓度为50μg/kg/d,连续14天;N组和H组新生大鼠于生后12小时内腹腔注射生理盐水,生理盐水与Gap26等量,连续14天。（2）实验方法:通过对肺组织切片行HE染色和计数辐射状肺泡数（RAC）值观察肺组织病理改变及定量检测肺泡发育状况。通过ROS、MDA和GSH试剂盒分别检测肺组织ROS、MDA和GSH水平。通过TUNEL荧光染色及Western blot检测cleaved caspase-3/caspase-3蛋白相对表达评估肺组织细胞凋亡情况。通过Western blot检测p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38/p38蛋白相对表达评估ASK1-JNK/p38通路活性。采用Real-time PCR方法检测Cx43在肺组织mRNA表达水平。应用免疫荧光方法检测Cx43在肺组织中的表达情况。利用Western blot方法评价Cx43在肺组织总蛋白和膜蛋白的表达水平。3.在体外细胞实验,探讨Cx43与氧化应激及细胞凋亡之间的潜在调控机制。（1）细胞模型和药物干预:体外培养RLE-6TN细胞系（大鼠ATII细胞）随机分为5组,包括N组（常氧组）、N+Gap26组（常氧+Gap26组）、H组（高氧组）、H+Gap26组（高氧+Gap26组）、H+NAC组（高氧+NAC组）。N组和N+Gap26组暴露于常氧环境（21%O2）,H组、H+Gap26组、H+NAC组暴露于高氧环境（85%O2）。利用ROS清除剂NAC（浓度为10 m M）处理高氧暴露的RLE-6TN细胞,评价ROS对Cx43表达及细胞间通讯能力的影响,评价ROS对细胞凋亡的影响。利用Cx43-GJCs阻断剂Gap26（浓度为150μM）处理高氧暴露的RLE-6TN细胞,评价Cx43-GJCs对ROS水平、细胞凋亡水平及ASK1-JNK/p38信号通路活性的影响。（2）实验方法:通过细胞接种荧光耦联实验检测细胞间通讯能力。采用Annexin V-FITC/Propidium Iodide双染方法检测细胞凋亡率。Cleaved caspase-3/caspase-3蛋白相对表达由Western blot方法检测。利用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针评估细胞ROS水平。p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38/p38蛋白相对表达由Western blot方法评估得出。通过免疫荧光观察Cx43细胞表达;利用Western blot检测Cx43总蛋白和膜蛋白表达水平;利用Real-time PCR检测Cx43 mRNA表达水平。结果:第一部分:1.BPD新生大鼠肺泡发育不良。HE染色及RAC值结果提示,N组肺泡发育良好,H组肺泡发育不良。H组肺泡发育情况符合BPD病理改变。2.BPD新生大鼠肺组织氧化应激水平增高。和N组相比,H组ROS水平、MDA水平显著升高（P＜0.01）,GSH水平显著降低（P＜0.01）。3.BPD新生大鼠肺组织细胞凋亡增多TUNEL染色及凋亡指数（AI）统计分析结果提示,H组凋亡指数（AI）显著高于N组（P＜0.01）。H组cleaved caspase-3/caspase-3蛋白相对水平高于N组（P＜0.01）。4.BPD大鼠肺组织Cx26、Cx32、Cx43和Cx46的表达。（1）免疫组化结果提示,Cx26、Cx32、Cx43和Cx46在N组均有表达,H组中Cx43表达显著增多。（2）免疫荧光双染结果提示,Cx26在ATI和ATII均有表达,以ATII为主;Cx32仅在ATII表达;Cx43在ATI和ATII均有表达;Cx46在ATI和ATII均有表达,以ATI为主。（3）Real-time PCR结果提示,H组肺组织Cx26、Cx32、Cx43和Cx46 mRNA表达水平均高于N组（P＜0.01）。（4）Western blot结果提示,和N组相比,H组中Cx26膜蛋白和总蛋白表达均于生后7天开始显著升高,生后14天达高峰（P＜0.01）;H组Cx32膜蛋白表达于生后7天开始显著升高,生后14天达高峰（P＜0.01）,而H组Cx32总蛋白表达无明显变化;H组Cx43总蛋白表达于生后7天开始显著升高,生后14天达高峰（P＜0.01）,H组Cx43膜蛋白表达于生后1天即显著升高,且这种趋势持续至生后14天（P＜0.01）;H组Cx46总蛋白和膜蛋白表达与N组无差异。5.Cx43膜蛋白表达水平、ROS水平、AI和RAC值之间相关性分析。Cx43膜蛋白表达水平与ROS水平呈正相关（Pearson分析,P＜0.01）,Cx43膜蛋白表达水平与AI之间呈正相关（Pearson分析,P＜0.01）,Cx43膜蛋白表达水平与RAC值之间呈负相关（Pearson分析,P＜0.01）。第二部分:1.Gap26改善大鼠肺泡发育。肺组织HE染色及RAC值统计分析结果提示,H+Gap26组新生大鼠肺泡发育好于H组,H+Gap26组RAC值显著高于H组（P＜0.01）。2.Gap26减轻大鼠肺组织氧化应激反应。和H组相比,H+Gap26组ROS和MDA水平显著降低（P＜0.01）,GSH水平显著升高（P＜0.01）。3.Gap26降低大鼠肺组织细胞凋亡水平。TUNEL染色及AI统计分析结果提示,H+Gap26组AI显著低于H组（P＜0.01）。Western blot结果提示,H+Gap26组cleaved caspase-3/caspase-3蛋白相对表达水平显著低于H组（P＜0.01）。4.Gap26抑制大鼠肺组织ASK1-JNK/p38信号通路活性。Western blot结果提示,H+Gap26组ASK1-JNK/p38信号通路活性显著低于H组（P＜0.01）。5.Gap26下调大鼠肺组织Cx43表达。（1）Real-time PCR结果提示,H+Gap26组大鼠肺组织Cx43 mRNA表达水平显著低于H组（P＜0.01）。（2）Western blot结果提示,H+Gap26组大鼠肺组织Cx43总蛋白及膜蛋白表达水平均显著低于H组（P＜0.01）。（3）免疫荧光结果提示,H+Gap26组大鼠肺组织Cx43荧光强度低于H组。第三部分:1.高氧环境下,ATII细胞Cx43表达上调,细胞间通讯能力随之增强。高氧暴露12小时、24小时和48小时,ATII细胞Cx43表达逐渐升高（P＜0.01）,细胞间通讯能力也随之增强（P＜0.01）。2.高氧环境下,NAC下调ATII细胞Cx43表达及细胞间通讯能力,减少细胞凋亡。（1）流式细胞仪利用DCFH-DA探针检测细胞ROS水平结果提示,H+NAC组ROS水平显著低于H组（P＜0.01）。（2）Real-time PCR和Western blot结果提示,H+NAC组Cx43 mRNA、总蛋白及膜蛋白表达水平显著低于H组（P＜0.01）。细胞接种荧光耦联实验结果提示,H+NAC组细胞间通讯能力显著低于H组（P＜0.01）。（3）Annexin V-FITC/Propidium Iodide双染评价细胞凋亡率所得数据显示,H+NAC组细胞凋亡率显著低于H组（P＜0.01）。3.高氧环境下,Gap26下调ATII细胞ROS水平,抑制ASK1-JNK/p38信号通路活性,减少细胞凋亡。（1）细胞接种荧光耦联实验结果提示,H+Gap26组细胞间通讯能力显著低于H组（P＜0.01）。（2）流式细胞仪利用DCFH-DA探针检测ROS水平结果提示,H+Gap26组ROS水平显著低于H组（P＜0.01）。（3）Western blot结果提示,H+Gap26组ASK1-JNK/p38信号通路活性显著低于H组（P＜0.01）。（4）Western blot结果提示,H+Gap26组cleaved caspase-3/caspase-3蛋白相对表达显著低于H组（P＜0.01）。Annexin V-FITC/Propidium Iodide双染评价细胞凋亡率所得数据显示,H+Gap26组细胞凋亡率显著低于H组（P＜0.01）。4.高氧环境下,Gap26下调ATII细胞Cx43表达。（1）免疫荧光结果提示,H+Gap26组Cx43荧光强度低于H组。（2）Western blot结果提示,H+Gap26组Cx43总蛋白及膜蛋白表达水平显著低于H组（P＜0.01）。（3）Real-time PCR结果提示,H+Gap26组Cx43 mRNA表达水平显著低于H组（P＜0.01）。结论:1.Cx26、Cx32、Cx43和Cx46在BPD大鼠肺组织mRNA水平高表达;Cx26和Cx43在BPD大鼠肺组织总蛋白水平高表达;Cx26、Cx32和Cx43在BPD大鼠肺组织膜蛋白水平高表达。其中,Cx43膜蛋白高表达发生的时间最早,且持续时间最长。2.Cx43-GJCs阻断剂Gap26抑制BPD大鼠肺组织ASK1-JNK/p38信号通路活性,减少氧化应激及细胞凋亡水平,改善大鼠肺泡发育。3.在高氧暴露ATII细胞,Cx43表达上调,细胞间通讯能力随之增强;Cx43-GJCs阻断剂Gap26阻断过度增强的细胞间通讯能力,抑制ASK1-JNK/p38信号通路活性,降低ROS水平及细胞凋亡水平。4.ROS上调Cx43表达;Gap26下调ROS水平,反馈性下调Cx43表达。ROS与Cx43之间可能存在交互调控的关系。