结直肠癌是全世界发病率排名第三的恶性肿瘤，每年有超过100万患者确诊为结直肠癌，且约有60万人死于结直肠癌，其总的5年生存率仅为50-70%。结直肠癌主要通过脉管方式（淋巴管和血管）向远处转移，部分患者在就诊时已出现淋巴结及血管转移，这些结直肠癌患者的预后较差。早、中期结直肠癌的治疗手段仍然以手术治疗为主，而中、晚期结直肠癌则以放化疗为基础联合靶向药物治疗为主要手段。目前以血管内皮生长因子（VEGF）和表皮生长因子受体（EGFR）为靶点的两类靶向药物在结直肠癌临床治疗中得到了广泛的应用，并取得了可喜的效果，但是原发性或继发性耐药的问题严重影响了靶向药物的临床疗效。c-Met是由原癌基因c-met编码的是一类重要的酪氨酸激酶受体，在结直肠癌细胞中过量表达，且与肿瘤增殖、迁移、侵袭、肿瘤血管形成及肝转移密切相关。其特异性配体为肝细胞生长因子/离散因子（HGF/SF）。临床证据显示，65%结肠癌原发灶或者转移灶组织中的c-Met的表达水平明显高于正常的结肠黏膜上皮组织，且外周血血清中和肿瘤组织中的HGF表达水平明显升高。这些证据提示了c-Met可以成为结直肠癌治疗的重要靶点，也使得对基于c-Met的分子靶向治疗联合传统放化疗在结直肠癌上抗肿瘤活性和作用机制的探讨至关重要。在前期实验中我们采用慢病毒介导的可调控诱导小干扰RNA（smallinterfering RNA, siRNA）技术，在人结肠癌细胞SW620上建立稳定可调控细胞系，抑制c-met基因的表达。适当沉默c-Met后，SW620的增殖明显低于对照组。本实验则继续探讨：适当沉默c-Met后联合传统化疗对人结肠癌细胞SW620的增殖及迁移的影响。目的：将构建成功含有人c-Met基因可调控shRNA的重组质粒进行慢病毒包装，感染SW620细胞并筛选出稳定可调控诱导的细胞系。探讨适当敲除c-Met后联合化疗对SW620细胞增殖、迁移的影响。方法：1将pMDL、pRSV、VSVG辅助质粒及重组的pSD400-c-Met-shRNA质粒按一定比例混合，在Megatran1.0介导下，共转染293T细胞进行病毒包装，收集病毒液并感染SW620细胞，利用嘌呤霉素（puromycin）筛选出稳定表达针对c-met的shRNA的细胞株。2用多西环素（Doxycycline）诱导稳定细胞系，用Western-blot和免疫荧光的方法，在蛋白水平检测稳定可调控细胞系c-Met的表达量。3利用Transwell的方法，检测适当敲低c-Met后SW620细胞的迁移能力。4利用alamar-Blue和Colony formation的方法，检测c-Met敲低后联合化疗药对SW620细胞增殖的抑制。结果：1用质粒共转染293T进行慢病毒包装，收集48小时的病毒感染SW620细胞24小时，加嘌呤霉素筛选一周，然后将形成的单克隆扩大培养。2免疫荧光法结果显示，400nM多西环素可明显抑制pSD400-c-Met-shRNA-SW620细胞中c-Met的表达。3用不同浓度（0、1、10、100、400、1000nM）的多西环素（DOX）诱导pSD400-c-Met-shRNA-SW6203天，Western-blot检测c-Met表达量随DOX浓度的增加而逐渐下降。用400nM的DOX诱导稳定细胞系3天，Confocal检测c-Met的表达量较未诱导组明显下降。成功构建稳定可调控细胞株。4Transwell检测到适当敲低c-Met后，迁移到小室下面的SW620细胞的数目较未敲低c-Met组减少。5用Colony formation方法检测适当敲低SW620细胞的c-Met表达后联合5-Fu、Taxol，细胞克隆形成较未敲低组少。6用alamar-Blue的方法测适当敲低SW620细胞的c-Met表达后联合5-Fu对细胞的增殖抑制能力增强。结论：1成功构建针对c-Met基因可调控表达的siRNA慢病毒载体，并能得到稳定的细胞系。2适当敲除SW620细胞的c-Met表达能够显著抑制肿瘤细胞的迁移。3适当敲除c-Met表达可以增加SW620对化疗的敏感性。