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本研究用烟草为模式植物,建立了烟草中四种主要生物碱及尼古丁的代谢物-可替宁的分离分析的常规方法。以斜纹夜蛾、烟青虫和棉铃虫三种夜蛾科昆虫为模式昆虫,通过测定它们取食烟叶后的虫体、虫粪,比较分析三种夜蛾科昆虫对烟草生物碱的排除机制。昆虫取食或机械性损伤都能激活烟草植株的系统性防卫反应,诱导根部尼古丁运输至受伤及相邻部位。正是在烟草与昆虫互作效应的基础上,选取了一种与烟株创伤信号相颉抗的仿生型信号分子(BSM),研究其与品种、施肥量以及打顶时期等栽培因素的互作效应。优化BSM的应用,从而将烟草生物碱总量及生物碱组成控制在合适的范围,为烟草生物碱的调控提供一条新途径。
论文主要工作总结如下:
1.通过大量实验,探索出了一种简单、快速和可靠的反相高效液相色谱法测定烟草中降烟碱、新烟草碱、假木贼碱、尼古丁及其代谢物可替宁的含量。系统的优化了前处理过程中萃取溶剂和萃取方式,应用C18固相小柱进行样品的纯化。通过优化色谱条件最终确定了最佳的仪器测定条件,并从线性范围、精密度和回收率等方面对分析方法进行了验证。实验结果表明,方法具有较宽的线性范围和较高的回收率,五种物质的相对标准偏差在0.89-3.56%之间,整个实验过程加标回收率均大于90%,适合于烟草中生物碱的分析测定。
2.烟草是斜纹夜蛾、烟青虫和棉铃虫的共同寄主,利用已建立的高效液相色谱法测定虫体、虫粪和取食的烟叶中生物碱和可替宁的含量以确定昆虫摄取的生物碱是否被吸收、截留、代谢和排泄,从而确定三种夜蛾科昆虫对生物碱的排除机制。结果表明,只有少量生物碱被截留和解毒成可替宁,分别有82.1%、84.1%和87.7%的总生物碱可以在斜纹夜蛾、烟青虫和棉铃虫的虫粪中获得。说明烟青虫和棉铃虫这两种嗜烟性昆虫不仅可以通过口腔分泌物来抑制烟草植株中生物碱的合成,同时具有比斜纹夜蛾更强的生物碱代谢能力和排泄能力。放置后的斜纹夜蛾虫粪中,生物碱含量降低,可替宁的含量却增加,表明虫粪中的尼古丁可以在外界环境如空气或微生物条件下自然降解。通过排泄作用排除生物碱是三种夜蛾科昆虫之所以能适应烟草作为寄主植物的主要机制之一。
3.用源于取食烟草的寡食性昆虫口腔分泌物的仿生型信号分子(BSM)在不同条件下、对不同类型烟草在打顶后进行涂抹处理。用HPLC检测BSM处理株和对照株烟叶中主要生物碱的含量,分析探讨了BSM在不同条件下对烟草生物碱的抑制作用。结果表明:BSM对不同类型烟草打顶后叶片上生物碱的积聚均有不同程度的抑制作用。BSM对烤烟9717中降烟碱的影响最大,中部和上部叶分别降低55.78%和63.40%,上部叶各生物碱降幅均大于中部叶,其中尼古丁和总生物碱分别降低25.49%和26.28%。BSM的浓度对白肋烟中生物碱的抑制效应也有影响,0.1mol/L的BSM对尼古丁的影响最大,中、上部叶的降低率分别达22.99%和42.45%,总生物碱则分别降低22.21%和37.73%;0.2mol/L的BSM可使降烟碱的量显著降低,中部和上部叶分别降低62.94%和58.53%。施氮量对BSM的抑制效应也有影响,在高的施氮量(9kgN/667㎡)下抑制效果更好,可使K326上部叶总生物碱降低34.76%。
4.研究了烤烟云烟85在7kgN/667㎡和9kgN/667㎡施氮量时,在现蕾、初花、中花和盛花四个不同花期打顶后施用BSM对烟株中各生物碱含量的影响。结果表明,在两种施氮量时,BSM对不同花期处理的烟株中生物碱的积累均有抑制作用。在现蕾期处理可有效抑制尼古丁积累,在中花期处理可显著降低三种微量生物碱的积累。就两种施氮量而言,在9kgN/667㎡时各花期处理后的烟株中生物碱含量与对照相比降幅较大。