论文部分内容阅读
钙依赖蛋白激酶（CDPKs）是一类仅在植物和部分原生生物中存在的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。CDPKs是Hetherington和Trewavas（1982）在豌豆中首先报道的，并由Harmon等（1987）在大豆中第一次得到纯化和鉴定。自从Harper等（1991）从大豆中首次克隆出编码CDPK的基因以来，至今已在16种高等植物、6种低等植物和4种原生生物中克隆出95个CDPK基因。CDPKs是一个多基因家族，其中拟南芥有34个CDPKs。CDPKs在植物钙信号转导中具有重要的作用，越来越多的证据表明，在植物碳氮代谢、离子和水分跨膜运输、细胞骨架调节、气孔运动调节、生长发育调节以及生物和非生物胁迫应答反应中均有CDPKs的参与。 本研究采用RT-PCR技术并结合RACE策略，成功地首次从蚕豆下表皮和叶片中克隆了编码CDPK的全长cDNAr VfCPK1和cDNA片段VfCPK2，并对VfCPK1的表达特征进行了初步研究。研究结果表明，用RT-PCR技术，以CDPKs激酶区的保守氨基酸设计的一对简并引物，从蚕豆下表皮中扩增到了3个141 bp（141-1、141-2和141-3）的cDNA片段；用RACE技术，以141-1序列设计的一对基因特异性引物，克隆到全长cDNA序列VfCPK1。用RT-PCR技术，以CDPKs激酶区和连接区的保守氨基酸设计的一对简并引物，从蚕豆叶片中还扩增到了3个618 bp（618-1、618-2和618-3）的cDNA片段；用RACE技术，以618-1序列设计的一对基因特异性引物，克隆到了还缺少5’末端的cDNA片段VfCPK2。 VfCPK1的全长为1785 bp，其中编码区为1479bp，可编码493个AA，5’非编码区为127bp，3’非编码区为179bp，中间含有加尾信号AATAAA，末尾是poly（A）。由编码区推测的VfCPK1的493个氨基酸序列具有已报道的CDPK的所有典型结构特征，由N端到C端可分为可变区、激酶区、连接区和调节区四个结构域。N端的可变区有26个氨基酸残基，没有豆蔻酰化所必需的保守序列MGXXC（S／Q）XXT，因此推测VfCPK1可能是水溶性蛋白。VfCPK1具有明显的Ca2+／钙调素依赖蛋白激酶及丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的激酶区以及类似于钙调素的钙结合区。激酶区长264个氨基酸残基，具有所有11个保守的亚结构域和15个对于真核生物丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶所必需的保守的氨基酸残基。连接区有31个氨基酸残基。C端的调节区有162个氨基酸残基，有4个非常保守的EF手性钙结合结构域。 推测的VfCPK1蛋白质序列与植物中的许多CDPKs具有很高的同源性，包括大豆种子CDPKa（同源性82％；29892113）、大豆SK5（CDPKα；同源性82％；116054）、大豆种子CDPKb（同源性80％；29892204）、马铃薯RiCDPK2（同源性79％；15289760）、大豆CDPKβ（同源性79％；2501764）、水稻CDPK（同源性78％；34147319）、玉米ZmCPK11（同源性78％；31747505）等。与拟南芥34个CDPKs相比，VfCPK1与AtCPK12、AtCPK4和AtCPK11的同源性最高，分别为77％、75％和74％。 通过Northem和Western blot分析，我们研究了蚕豆钙依赖蛋白激酶VfCPK1在蚕豆不同部位包括根、茎、叶、叶肉和下表皮中的mRNA和蛋白质水平上的表达情况以及不同外界胁迫处理对VfCPK1表达的影响。实验结果表明，无论是在mRNA还是蛋白质水平上，VfCPK1都是在叶片中的表达量显著高于根和茎中的表达量，尤其是在下表皮中的表达量最大，而在根和茎中的表达量低。因此，VfCPK1主要分布于蚕豆的叶片中，尤其在下表皮中。 当用不同浓度的PEG和不同的处理时间处理蚕豆叶片时，在mRNA和蛋白质水平上，垮℃尸犬了在叶片中的表达量都有增加。当PEG处理浓度为20%时，学，尤了的表达量最大。无论是在转录还是蛋白质水平上，20%PEG处理Zh后，吠沪尤少在叶片中的表达量开始升高，处理sh后，表达量达到最大。当用100林M ABA对蚕豆叶片胁迫处理不同时间后，叨护犬了在叶片中的转录水平的变化呈现出类似于20%PEG不同时间处理的表达模式。这表明，干早胁迫或外源ABA诱导了叨，犬了在蚕豆叶片中的表达。当用Cacl:处理叶片时，叨，犬了在蚕豆叶片中的表达显著增加，而用Mgcl:和Nacl处理时，叨，犬了的表达没有变化，说明c扩+不仅是cDPK的酶活性依赖因子，而且还能刺激cDPK的基因表达。另外，低温（4℃）和高温（37℃）处理对巧℃尸犬了在蚕豆叶片中的表达没有影响。 本论文还研究了玉米根液泡膜蛋白V.ATPaseA亚基磷酸化对V州ATPase活性的影响并鉴定了A亚基磷酸化位点。结果表明，A亚基的磷酸化可明显提高V.ATPase的ATP水解活性和H+转运活性。进一步研究表明，A亚基的潜在磷酸化位点为Ser525。就我们所知，这是首次确定植物v一ATPaseA亚基的磷酸化位点。据推测，玉米根V一ATPase的A亚基可能是在这个丝氨酸位点被CDPK磷酸化。