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肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,是广西常见和高发的恶性肿瘤。联合化疗是肝癌治疗的重要措施,但化疗效果不佳,除与70%肝癌天然耐药有关,MDR已成为肝癌治疗的最大障碍。目前MDR逆转剂的机制单一、明显剂量限制性及体内难以达到所需血药浓度,其临床应用受到限制,因此,从天然资源中寻求高效、低毒、作用靶点广泛的耐药逆转剂已成为当前MDR研究的必然趋势和热点。MDR的机制复杂,涉及细胞内多种蛋白、酶类和基因的改变以及细胞外环境的变化。其中以ABC型载体转运蛋白的过度表达为经典机制,P糖蛋白最具代表。非经典机制可能涉及通过改变特异性酶系统活性降低药物细胞毒作用;凋亡相关调控途径受阻;细胞代谢转化改变;体内药代动力学因素等。此外,值得注意的是,同一肿瘤不同瘤株产生MDR的机制也可不同。MDR的产生并不是单一因素导致的,而是多种因素共同作用的结果。目前研究认为,绿茶的儿茶素单体EGCG通过多种途径抑制肿瘤的形成、生长和转移,并协同化疗药物对肝癌MDR细胞抗增殖、诱导分化和诱导凋亡,具有一定逆转MDR作用。肿瘤MDR机制的复杂和EGCG逆转MDR的多途径,高通量基因芯片技术探讨EGCG逆转肝癌MDR分子作用机制尚未见报道。目的:选用两株不同化疗药物诱导耐药的肝癌细胞株,利用基因芯片技术从肝癌MDR及EGCG耐药逆转剂两个角度对多个参量同时进行研究,以探讨EGCG的可能耐药逆转作用机制。内容:1.人肝癌多药耐药细胞系BEL7404/ADM和BEL7402/5FU的培养:BEL7404/ADM细胞采用浓度梯度递增和高浓度间歇冲击法诱导,建立并提高耐药倍数,0.5mg/LADM维持;BEL7402/5FU购自于南京凯基生物技术有限公司,20mg/L 5FU维持。两株细胞均在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养,培养基为含有10%灭活小牛血清,100U/青霉素和100mg/L链霉素的RPMI1640培养基。2.甲基四唑蓝（MTT）法药物敏感性实验:2.1分别检测两株敏感细胞株和耐药细胞株对多种化疗药物的IC50,确定相应耐药指数。2.2分别检测EGCG对两株耐药细胞的毒性作用,根据LOGIT软件求得10%的细胞生长受到抑制所需药物浓度(IC10)。选取低于IC10。的EGCG浓度进行逆转耐药性浓度依赖实验,并确定最佳逆转浓度剂量。3.基因芯片分析最佳逆转浓度EGCG作用两株肝癌耐药细胞的基因表达谱的差异,探讨EGCG的可能耐药逆转作用分子机制。3.1表达谱cDNA微阵列的制备。从IMAGE人类cDNA文库直接点样8064个靶基因,另挑选10个与肝癌耐药相关靶:基因进行RT-PCR扩增和纯化后制备成探针,点样、水合、紫外交联于氨基玻片上,制备成表达谱cDNA微阵列。3.2 EGCG作用两株肝癌耐药细胞的基因表达谱差异两株肝癌耐药细胞株分别分组:对照耐药细胞组和最佳逆转浓度EGCG作用48h耐药细胞组和,抽提总RNA,分离纯化为mRNA,逆转录Cy5/Cy3标记cDNA探针,与基因微阵列杂交并扫描分析。4.Western Blot方法分别检测相同处理条件下两株肝癌耐药细胞的Cyclin G1蛋白表达的变化,验证基因芯片CCNG1基因表达变化结果。结果:1.培养的ADM诱导耐药肝癌细胞BEL7404/ADM对ADM明显抗药性,耐药指数为39.6,对VCR、CDDP交叉抗药性、对5FU抗药性不明显。BEL7402/5fu细胞对5FU耐药指数为127.6,对ADM有交叉抗药性,对CDDP、VCR抗药性不明显。2.EGCG对BEL7404/ADM、BEL7402/5FU的IC10。分别为24.76mg/L、20.60mg/L,因此选择7mg/L、15mg/L、20mg/L三个浓度进行逆转耐药性浓度依赖实验,5mg/LVRP作阳性逆转剂对照。结果显示,三个浓度EGCG联合相应化疗药物均能增加肝癌耐药细胞株对化疗药物敏感性。对BEL7404/ADM耐药细胞株,逆转倍数分别为2.69倍、5.37倍、9.66倍,与阳性逆转剂VRP（5ma/L）相比逆转倍数6.48倍;对BEL7402/5FU耐药细胞株,EGCG联合5FU作用IC50。下降不显著,阳性逆转剂VRP IC50。下降无显著性。3.选用20mg/L浓度EGCG进行基因芯片机制探讨实验。芯片结果:不同组样品间表达差异基因的功能主要涉及细胞生长调节有关的细胞增殖和凋亡基因、DNA复制/转录基因、癌基因/抑癌基因以及细胞代谢、信号转导等多方面。EGCG作用BEL7404/ADM细胞双荧光通路显著差异基因210个,上调表达38个,下调表达172个。可能与耐药机制相关基因变化:ABCB10（MDR/TAP）、TOP2A、TOP2B、CCNG1上调,ABCB1、MVP、ARHD、HDAC5、GSS、GSTPI、HSPA1B、HSPB7、CDKN1A、RAB11B、RAB9P40下调等;EGCG作用BEL7402/5FU细胞双荧光通路显著差异基因179个,上调表达31个,下调表达148个。可能的机制相关基因变化:ABCG（BCRP）、CCNG2、GADD34、RB1、RBBP4上调,DTYMK、GPX1、USP5、BAX、BAK1、HSPA1L下调等。4.Westeyn blot实验相同处理条件下两组肝癌耐药细胞的Cyclin G1蛋白表达均增加,与cDNA microarray基因水平变化一致。结论:1.EGCG多基因、多环节、多途径改变参与逆转ADM诱导的肝癌MDR,涉及编码经典转运蛋白基因,ABCB1、ARHD、HDAC5基因下调MDR1基因降低P-gp表达;ABC膜跨膜蛋白基因家族如MVP、ABCD10（MDR/TAP）基因变化。对非经典耐药途径基因影响,如编码TOPO酶、GSH-GST系统、HSP70、PKC、MMP系列基因变化,存在多靶点作用。2.EGCG对5FU诱导的肝癌MDR逆转作用不明显,与5FU耐药机制不同于经典跨膜转运蛋白有关,可能与影响细胞周期关卡调控靶点、调控细胞凋亡基因失调有关。3.非细胞毒剂量的EGCG可能是协同化疗药物作用,影响细胞周期和细胞凋亡。4.同一肿瘤不同瘤株耐药机制不同,EGCG逆转耐药的作用有差异。5.Western blot实验结果蛋白变化与基因水平上一致,验证cDNAmicroarrays获得药物作用的分子标志谱是可行的,具有快速、高通量、高灵敏度特点,在分析肿瘤MDR和逆转药物作用机制有显著优势。