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增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是一种在DNA复制、DNA修复、细胞周期调控等机制中发挥重要功能的核蛋白,我们对人增殖细胞核抗原(human proliferating cell nuclear antigen,hPCNA)基因—538~+60区域启动子的调控做了比较全面的分析,着重研究了5′启动子中的血清刺激应答元件以及PCNA在细胞周期DNA损伤检查点(check point)机制中的转录调控.PCNA的合成在细胞周期中受严格调控.我们通过检测hPCNA启动子报告基因在同步化L-02细胞中的瞬时表达,分析了—538~+60范围内17个潜在元件对血清刺激启动子上调的贡献.发现位于-84~-75位的5′-TTCCCCGCAA-3′类E2F序列是血清诱导启动子上调的应答元件.在凝胶阻滞实验中,L-02核抽提物与含有-84~-75位类E2F序列的寡核苷酸形成两个结合条带,其中含量较少、分子量稍小的条带代表S期特异复合物,可被E2F-1抗体干扰.这是对hPCNA5′启动子区域中血清应答元件的首次描述.4-Nitroquinoline N-oxide(4-NQO)是一种很强的致突变剂和致癌物.DNA损伤检查点是细胞周期中的重要控制机制,它能够随时应答DNA损伤信号,休止细胞周期,诱导DNA修复.为了研究PCNA为一DNA复制、修复机器中的必需因子在DNA损伤检查点机制中的表达调控,我们研究了PCNA对4-NQO所致DNA损伤的应答.首先用瞬时转染的方法检测了Hep G2细胞中4-NQO对hPCNA启动子转录调控的影响,发现4-NQO在0~2μmol/L浓度范围内,以剂量依赖的方式通过-236~-217位p53结合元件激活hPCNA启动子转录,该转录激活作用需要p53蛋白参与.hPCNA作为一个看家基因,需要在不同细胞的各种生理状态下广泛地表达.我们利用报告基因系统检测了hPCNA启动子-538~+60区域内的17个潜在元件在HeLa、Hep G2、MCF7、L-02细胞中对启动子活力的贡献,发现-45位ATF位点是hPCNA启动子通用的转录元件;位于-210~-75区域的6个相邻元件:-199类RA位点、-186 SP1位点、-139CTF位点、-122 SP1位点、-94 CTF位点和-75 E2F位点突变hPCNA启动子活力也有较大影响,且存在一定的细胞特异性;-498类Ets-1位点、-216 p53位点、-64类AP2位点和+38类E2F位点对启动子活力的贡献在不同细胞株中差异较大,是细胞类型特异的转录元件.同时,我们还构建了-94 CTF位点和-75E2F位点双突变的报告质粒,对相邻转录元件之间的协同作用进行了初步的分析.