论文部分内容阅读
目的转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)作为一种新的基因修饰方法,自2011年以来成功应用于基因修饰以及动物模型的产生。FATS基因属于脆性位点基因,其编码序列位于基因组中AT富含区,特别是其有重要功能的最大外显子被含有重复序列的大片段AT富含区所包围,难以用常规胚胎干细胞同源重组方法实现定位敲除。为了建立FATS基因敲除小鼠模型,我们通过构建’TALEN打靶载体,并创新性地用TALEN双修饰法进行FATS基因敲除,探索高效建立基因敲除小鼠模型的新途径。方法1.采用生物信息学方法分析小鼠的FATS基因的编码序列,确定打靶载体的设计位点。针对其最大外显子部位设计两对TALEN载体,确保打靶成功率。2.一采用Golden Gate的方法组装TALEN打靶载体,载体组装完成后通过PCR和测序验证打靶载体是否正确,将序列正确的克隆进行质粒DNA提取和纯化。3.将FATS-TALEN打靶质粒DNA通过电穿孔方法转染小鼠HC11细胞,72小时后提取细胞基因组DNA,进行T7E1酶切实验,并通过T-A克隆测序验证FATS-TALEN打靶载体在细胞水平上的体外切割效率。4.体外鉴定FATS-TALEN载体有效后,将打靶载体DNA酶切线性化,通过T7转录试剂盒体外转录成具有5’帽子和3’polyA尾巴的成熟mRNA。对小鼠单细胞期受精卵进行原核注射,注射后的受精卵移植到假孕母鼠体内。5.待小鼠出生后,剪脚趾编号进行基因鉴定,确定阳性小鼠(FO, founder)。同时检测FATS-TALEN打靶载体在这些F0小鼠中是否有打靶非特异性(off-target)情况。6.将阳性小鼠和野生型小鼠交配,得到杂合的F1代小鼠,F1代小鼠自交得到纯合的FATS基因敲除小鼠。7.分别取一月龄的野生型小鼠、杂合小鼠、纯合小鼠睾丸提取蛋白质裂解液,通过Western blot检测FATS蛋白的表达情况。结果1.细胞实验结果证实,设计的两对TALEN都具有双链切割活性,通过TA克隆证实两对TALEN打靶载体的体外效率分别为25%和4.5%。2.两对TALEN打靶载体的体内致突变效率分别为17.2%和14.3%。在单对FATS-TALEN mRNA浓度不变的情况下,两对FATS-TALEN打靶载体同时注射到单细胞期的小鼠受精卵中,可以将阳性founder小鼠的比例增加到61.5%。并且通过两对TALEN的同时切割,实现了TALEN介导的染色体DNA长片段的缺失。3.T7E1酶切实验和测序结果证明TALEN具有很好的特异性和专一性,通过对全基因组相似序列的检测,没有检测到off-target现象。4.由TALEN引起的基因敲除可以通过生殖细胞传给下一代小鼠。5.通过Western blot实验证明在杂合基因敲除的小鼠体内,FATS基因的蛋白表达水平降低；在纯合基因敲除的小鼠体内,FATS基因的蛋白表达沉默。结论1.在每对FATS-TALEN mRNA浓度不变的情况下,两对TALEN同时注射可以显著提高阳性小鼠的比率,同时可以造成长片段的缺失突变,方便PCR快速鉴定。2. TALEN打靶载体具有很好的特异性,并且由TALEN引起的突变可由生殖细胞传给F1代小鼠。因此,TALEN双修饰技术进一步增强TALEN单修饰技术建立基因敲除模型的有效性和实用性,对脆性位点基因功能的系统性研究有深远的促进作用。