目的：阿尔采末病（Alzheimer’s disease,AD,又名阿尔茨海默病，早老性痴呆）是一类以进行性记忆力损伤和认知障碍为主要临床表现的中枢神经系统退行性病变，是老年痴呆最常见的一种形式。目前的研究认为，脑内β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）沉积形成的老年斑可能是AD致病的核心机制。近年的实验研究表明，神经甾体对包括AD在内的神经退行性疾病的治疗具有重要意义。本实验室前期研究发现，神经甾体孕酮（progesterone，PROG）和脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）可通过调节氨基酸类递质系统，降低神经系统的兴奋性，从而起到神经保护的作用；并且PROG能够浓度依赖的抑制Aβ诱导的神经毒性作用，提高神经元存活率。提示，PROG可能通过调节氨基酸类递质系统的兴奋性来对抗Aβ诱导的神经毒性作用，从而改善AD的症状。本研究将SD大鼠的大脑皮质神经元进行体外原代培养，采用Aβ活性片断Aβ_25-35体外诱导神经元损伤，用神经甾体PROG处理，采用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法检测细胞培养液中谷氨酸（GLU）和γ-氨基丁酸（GABA）的浓度；采用免疫细胞化学法测定神经元氨基酸受体亚单位NMDAR2B（NR2B）和GABAR2（GBR2）受体的表达，以观察PROG对AD样损伤神经元中氨基酸类神经递质释放及其受体表达的影响，进一步探讨PROG对抗Aβ所致神经元损伤的机制，从而为预防和治疗AD提供新的思路。方法:1大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及形态观察取新生SD大鼠大脑皮质，用胰蛋白酶消化并辅以机械分离法分离细胞，将其悬浮于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，活细胞密度调整为1.0×10⁹L^-1，培养板中预先放入包被L-多聚赖氨酸的圆形玻璃盖玻片并接种细胞，在37oC，5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中孵育，24h后首次换液为neurobasal完全培养基，以后每隔两天半量换液。取培养第10天的神经元供实验用。倒置显微镜下观察神经元的形态学变化。2分组和药物处理方案2.1建立Aβ_25-35致AD样神经元损伤模型取培养第10天的神经元，随机分为空白对照组（control）、GLU处理组(GLU浓度为1mmol·L^-1)及低、中、高3个浓度Aβ_25-35处理组(AβL、AβM及AβH，终浓度分别为0.1μmol·L^-1、1μmol·L^-1及10μmol·L^-1)，每组设6个复孔，加药处理并继续培养24h后，进行神经元形态学观察和MTT测定。2.2PROG处理对Aβ_25-35诱导的AD样神经元损伤的影响取培养第10天的神经元，随机分为空白对照组（control）、模型组（model）、及低、中、高3个浓度PROG处理模型组(PL、PM和PH，终浓度分别为0.001μmol·L^-1、0.01μmol·L^-1和0.1μmol·L^-1，各组同时加入模型组浓度的Aβ_25-35)，每组设6个复孔，加药处理并继续培养24h后，进行神经元形态学观察和MTT测定。2.3GLU、GABA浓度测定和NR2B、GBR2受体亚单位表达测定实验分组同“2.2”，每组设6个复孔，加药处理并继续培养24h后，取细胞培养液用HPLC-MS/MS法测定GLU、GABA浓度；取附着在盖玻片上的神经元用免疫细胞化学法测定NR2B、GBR2受体亚单位表达。3MTT法检测细胞存活率将细胞接种于24孔板，培养第10天，加药处理完后，每孔加入80μLMTT液(3.6mmol·L^-1)，37℃继续孵育4h，弃上清，加入300μL DMSO溶解甲瓒结晶，以空白孔调零，用紫外分光光度计测定570nm波长处的吸光度值，设空白对照组吸光度的均值为100%，以各样本吸光度值／空白对照组吸光度的均值为该样本的细胞存活率。4HPLC-MS/MS法测定细胞培养液中GLU和GABA的浓度取细胞培养液1ml置10ml离心管中，加入3ml甲醇涡旋震荡3min，离心（3000r·min-1,10min），取上清液40℃水浴氮气流下吹干，残渣用100μL浓度为50ng·ml-1的内标液吗啡（morphine，MOR）溶液溶解，进样5μL。用于HPLC-MS/MS分析的色谱条件：色谱柱为ZIC-HILIC柱（2.1mm×50mm，3.5μm，德国默克时光公司）；保护柱为C18柱（4mm×2.0mm，美国Phenomenex公司）；流动相为乙腈水=8:2（v/v，含0.5%甲酸）；流速：200μL·min-1；柱温：30℃，进样量：5μL。质谱条件：离子源为ESI源，正离子检测；喷雾电压（Spray Voltage）4.0kV；鞘气压力（SheathGas Pressure）45psi；辅助气压力（Aux Gas Pressure）2L·min-1；碰撞气压力（Collision Gas Pressure）1.0mTorr；离子传输管温度（CapillaryTemperature）350℃；反吹气压力（Ion Sweep Gas Pressure）20psi；检测方式为多离子反应监测（MRM）方式，用于定量分析的离子反应分别为m/z148→m/z130（GLU），m/z104→m/z87（GABA），m/z285→m/z200（MOR）。5免疫细胞化学法测定神经元氨基酸NR2B和GBR2受体亚单位表达神经元培养第10天，加药处理后，取出爬满神经元的玻璃盖玻片，细胞用生理盐水（4oC）漂洗两遍后晾干，4%多聚甲醛（4oC）固定，-20oC保存待测。受体亚单位采用ABC法染色，所染片子采用Image-Pro Plus5.1分析软件测定受体表达的平均光密度（MOD），每张片子随机选取6个视野，取均值作为该样本的MOD值。结果:1Aβ_25-35对原代培养SD大鼠皮质神经元的损伤作用1.1Aβ_25-35损伤SD大鼠皮质神经元的细胞形态学改变倒置显微镜下观察，培养第10天对照组神经元大部分聚集成团，突起相互交织形成网络；神经元胞体饱满，胞浆丰富。与对照组比较，GLU处理组神经元数量明显减少，部分细胞胞体肿胀，折光性降低，并伴有细胞膜破裂，生成碎片。三个Aβ_25-35处理组神经元数量随Aβ_25-35浓度增加呈明显减少趋势，且见胞体出现肿胀，折光性降低，其中AβH组细胞数量大体与GLU组相当。1.2Aβ_25-35对神经元存活率的影响采用MTT法检测。与对照组相比，GLU处理组大鼠皮质神经元有明显损伤，细胞存活率为（50.6±3.8）%（P<0.01）；三个剂量组Aβ_25-35处理后均使大鼠皮质神经元存活率降低，且在三个剂量组浓度范围内，Aβ_25-35浓度与细胞存活率之间存在明显的量效关系，Pearson相关系数为r=-0.982（P<0.01）。其中1μmol·L^-1Aβ_25-35处理组的细胞存活率为（51.1±3.7）%，神经元的损伤程度与神经细胞损伤传统模型之一的1mmol·L^-1GLU损伤比无统计学差异（P>0.05），说明Aβ_25-35诱导的AD样神经元损伤模型建立成功，Aβ_25-35的终浓度为1μmol·L^-1。2PROG处理对Aβ_25-35诱导的AD样神经元损伤的影响倒置显微镜观察，与对照组比较，模型组(1μmol·L^-1Aβ_25-35)神经元数量明显减少，且不同浓度的PROG与Aβ_25-35共孵育24h后，神经元数量随PROG浓度升高呈明显增加趋势。经MTT法检测，与对照组比较，模型组大鼠皮质神经元损伤明显，细胞的存活率为（50.2±3.3）%（P<0.01）；与模型组比较，给予0.001μmol·L^-1、0.01μmol·L^-1及0.1μmol·L^-1的PROG与Aβ_25-35共孵育24h后，大鼠皮质神经元的存活率呈顺浓度梯度显著增加，并且在上述浓度范围内，PROG与细胞存活率间存在明显的量效关系，Pearson相关系数为r=0.980（P<0.01）；其中0.1μmol·L^-1PROG处理组的细胞存活率为（100.2±2.6）%，与对照组比较无统计学差异（P>0.05）。3氨基酸测定方法学确证及PROG处理对Aβ_25-35诱导的AD样损伤神经元GABA和GLU释放的影响本实验所用HPLC-MS/MS测定氨基酸方法GABA和GLU与细胞培养液中各杂质成份分离良好，无干扰；GLU和GABA在5⁵00ng·mL^-1范围内线性关系良好；GLU和GABA日内、日间RSD均分别小于7.4%和8.6%，提取回收率均大于89%。最低定量限（LLOQ）均为5ng·mL^-1。经HPLC-MS/MS法测定，与对照组相比，模型组(1μmol·L^-1Aβ_25-35)的GLU水平显著升高，升高率为48.8%（P<0.01）；GABA水平显著降低，下降率为30.3%（P<0.01）。与模型组比较，给予0.001μmol·L^-1、0.01μmol·L^-1及0.1μmol·L^-1的PROG处理后GLU水平呈显著降低趋势，分别降低35.9%、43.1%和51.3%（P<0.01），其中高剂量组GLU水平与对照组相比无统计学差异（P>0.05）；而GABA水平呈显著升高趋势，分别升高11.7%、23.4%和41.8%（P<0.01或P<0.05），其中高剂量组GABA水平与对照组相比无统计学差异（P>0.05）。且在上述浓度范围内，PROG与GLU和GABA的水平存在明显的量效关系，Pearson相关系数分别为r=-0.951（P<0.01）和r=0.844（P<0.01）。4PROG处理对Aβ_25-35诱导的AD样损伤神经元NR2B和GBR2表达的影响体外培养的SD大鼠大脑皮质神经元，其NR2B和GBR2受体亚单位经免疫细胞化学染色后，显微镜下可观察到：神经元的胞浆、胞膜及部分突起呈棕黄色着色，为其阳性表达。与对照组相比，模型组NR2B和GBR2表达均显著降低，降低率分别为40.8%（P<0.01）和44%（P<0.01）。与模型组比较，给予0.001μmol·L^-1、0.01μmol·L^-1及0.1μmol·L^-1的PROG处理后，NR2B和GBR2表达均呈显著升高趋势，使NR2B升高24.4%、33.9%、59.6%（P<0.01），其中高剂量组NR2B水平与对照组相比无统计学差异（P>0.05）；使GBR2表达水平升高41.5%、48.3%、65.9%（P<0.01），其中高剂量组GBR2水平与对照组相比无统计学差异（P>0.05）。结论:1本研究成功建立Aβ_25-35体外诱导原代大鼠皮质神经元损伤的AD细胞模型。Aβ_25-35诱导的神经损伤对神经元存活率的降低具有浓度依赖性，其作用浓度为1μmol·L^-1时神经元存活率降低约50%，与1mmol·L^-1GLU损伤程度相当。2PROG能够浓度依赖地抑制Aβ_25-35诱导的神经元损伤，提高神经元存活率，其中0.1μmol·L^-1PROG处理可使神经元存活率恢复到正常组水平。3Aβ_25-35诱导AD样损伤神经元GLU释放显著增加、GABA释放显著降低，而PROG处理能够浓度依赖的降低GLU水平、增加GABA水平。提示，PROG抑制Aβ_25-35诱导的神经元损伤，提高神经元存活率的机制，可能通过减弱GLU释放、增强GABA样抑制作用完成。4Aβ_25-35诱导AD样损伤神经元中NR2B和GBR2受体亚单位的表达均显著降低，而PROG处理能浓度依赖的升高NR2B和GBR2表达水平。提示，PROG对神经元NR2B和GBR2表达的调节可能是其抑制Aβ_25-35诱导的神经元损伤，提高神经元存活率的机制之一。