由于鸡的特殊生殖现象,母鸡在体内完成受精后产出种蛋,种蛋中鸡胚已经发育到几千上万个细胞。已有的转基因鸡的制备过程中,利用鸡胚原始生殖细胞迁移,并结合慢病毒载体转基因方法,产生嵌合体鸡,再通过下一代的繁殖以期获得转基因鸡,其效率和研究时间均值得商榷。虽然已有芳香化酶基因表达调控研究,但到目前为止还没有芳香化酶基因敲除鸡的诞生。因此,本论文企图建立鸡胚操作技术体系,利用芳香化酶基因敲除载体,在鸡胚上制备芳香化酶基因敲除鸡,建立以鸡胚基础制作禽类基因修饰鸡的技术体系,为禽类基因组学研究和禽类疾病相关基因修饰创制奠定基础。为了利用鸡胚实现制作芳香化酶基因敲除鸡,本论文设计了三方面研究内容:芳香化酶基因敲除载体设计与验证。本论文利用CRISPR/Cas9技术设计和构建芳香化酶基因敲除的6个sg RNA,在鸡胚成纤维细胞上验证是sg RNA2、sg RNA2和sg RNA6可完成芳香化酶基因敲除。这为制作基因敲除鸡成功建立了载体体系。然后在将构建好的载体连接在质粒上,通过瞬时转染的方法对鸡胚成纤维细胞进行T7E1酶切。对酶切结果进行检查发现sg RNA2和sg RNA5组合后酶切效果最好。进一步进行靶位点克隆再测序发现都能实现敲除效果,而且sg RNA2和sg RNA5组合后实现了敲除。对靶位点进行脱靶实验中,选取了5个容易脱靶的位点进行检查,也没有出现脱靶。鸡胚操作方法研究。由于鸡胚位置在卵中具有不确定性,本研究首先将鸡胚水平放置6小时和24小时,结果鸡胚开孔发现鸡胚偏离率在24小时最低;鸡蛋开窗后,发现石蜡壳膜封口方法较好。对不同开口大小鸡蛋进行失重率统计,发现差异不显著。对鸡胚毒性观察时,结果注射敲除质粒后的鸡胚发育率和成活率高。对母鸡产蛋影响因素进行观察得到增加一项因素产蛋率逐渐下降。通过灌卵手术没有生产出硬壳鸡蛋。鸡胚芳香化酶基因敲除的探索。首先我们使用慢病毒载体GFP转染鸡胚得到了发育3天的转基因鸡胚。另一方面,我们用GFP质粒和GFP(RNA)转染混合物转染鸡胚得到绿色荧光鸡胚。提取组织DNA后进行PCR反应得到了目的条带。本实验最后没有制作出芳香化酶基因敲除鸡。这项研究虽然没有产出转基因鸡,但是却利用了非病毒方法制作基因修饰鸡做了尝试,对性别反转研究进行了探索。由于鸡的特殊生理特性,敲除的片段较大,影响鸡胚发育的因素多,为实验增加了难度。