水貂肠炎细小病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备与IPMA方法的建立

来源 :新疆农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhongkelong
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水貂肠炎细小病毒(MinkEnteritisVirus,MEV)又称水貂细小病毒,由其引起的水貂病毒性肠炎对水貂的生长和毛皮质量都有很大的影响。自从1981年我国初次发现此病以来,随后接连在多省的水貂养殖场内检测出该病病毒。本研究的目的有二:一是通过构建pET-32a-VP2的重组质粒,转化至大肠杆菌原核表达系统,获得重组蛋白。以该重组蛋白对新西兰大白兔进行免疫,获得MEVVP2多克隆抗体,为实验室后续研究MEVVP2的相关结构提供基础。二是建立MEV的免疫过氧化物酶单层细胞实验(ImmunoperoxidaseMonolayerAssay,IPMA),为貂场MEV的检测和防控提供可靠简便的方法。所获得的结果如下:  根据GenBank数据库中MEVVP2基因序列,经多序列比对,并在上下游两端引入BamHI和XhoI酶切位点,设计了引物VP2F和VP2R,以MEV全基因组重组质粒pB-MEV-L为模板,利用PCR技术,扩增出MEVVP2片段,该片段与pET-32a载体连接,转化至DH5α感受态细胞中,经酶切与序列测定,证明成功构建了VP2基因原核表达质粒pET-32a-VP2。将该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导,高效表达了pET-32a-VP2重组蛋白。经免疫印迹实验证明,获得的重组蛋白具有较好的反应原性。将纯化后的蛋白作为免疫原,免疫新西兰兔,制备抗血清。经四次免疫后,用ELISA方法检测该抗血清效价,效价达到1:1024;经免疫荧光实验证明,获得的抗体与MEV具有良好的结合活性。  建立了一种在血清中检测MEV抗原的IPMA检测方法,并对该检测方法的特异性、敏感性、重复性以及病毒感染检出时间进行了实验验证。结果显示:细胞接毒48h后进行固定和检测效果最佳;一抗最佳稀释度为1:100,最适作用时间为60min;二抗最高稀释度为1:2000,最佳孵育时间为90min;该IPMA方法与犬瘟热病毒、犬冠状病毒、水貂阿留申病毒无交叉反应;对培养的MEV稀释10-5仍能用该方法检出,敏感性较PCR方法高1个稀释度;该方法的重复性良好;对大鼠接毒第4天后即可在血液中检测出MEV;对采集的90份水貂血样进行检测,结果显示MEV感染阳性水貂血样为19份,感染率为21%。
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