人工合成寡糖促进乙型肝炎病毒抗原诱导免疫应答的研究乙型肝炎病毒(Heptitis B virus，HBV)属于嗜肝DNA病毒科，具有严格宿主特异性。HBV感染引起的乙型肝炎是严重危害人类健康的传染病，可引起急性或慢性肝炎，并且与原发性肝细胞癌的发生密切相关。尽管乙型肝炎病毒疫苗和药物在临床上广泛应用以及新的疫苗和药物的深入研究，但是乙型肝炎病毒感染仍然是全球范围内影响人类健康的重要因素，据世界卫生组织报告目前在全球范围内约有4亿的人群是乙型肝炎病毒的携带者，而且每年仍然有5千万的人群感染HBV。因此开发新的HBV预防和治疗性疫苗显得尤为重要，本文主要在此背景下研究人工合成寡糖(在本文中命名为β寡糖)作为佐剂对乙肝疫苗诱导免疫应答的影响。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)作为疫苗在临床上被广泛应用于预防HBV感染，能产生高亲和力的中和抗体，与病毒相互作用产生有效的免疫应答，达到预防HBV感染目的。虽然HBsAg被认为是目前有效的HBV预防疫苗，但是在疫苗接种人群中仍有10％左右的接种者不能产生高滴度的保护性抗体，从而导致疫苗接种失败。DNA疫苗能诱生较强的特异性CD8~+T细胞应答成为人们研究预防和治疗性疫苗的热点，但在大型哺乳动物和人类中所诱导的免疫应答强度相对较低。虽然临床应用中DNA疫苗诱导的T细胞免疫原性较弱，但是DNA疫苗的研究和开发还是具有广阔的前景。鉴于目前的乙肝疫苗还存在免疫原性弱的问题，而且慢性乙肝的一个原因是机体的免疫应答较弱，因此，寻找一种有效的免疫佐剂来增强HBsAg蛋白疫苗和乙肝病毒DNA疫苗诱导的免疫应答或改变免疫应答类型是开发HBV疫苗的策略之一。蘑菇和灵芝等在中国传统医学中被用于疾病的预防和治疗，而且天然的灵芝和蘑菇在中国的食品和药品领域也具有悠久的历史。目前研究发现从不同机体如细菌，真菌，植物和其他的有机体提取的多糖具有良好的免疫调节效应，可与宿主细胞如巨噬细胞和树突状细胞表面的选择性受体(如dectin-1)相互作用，从而激活巨噬细胞和树突状细胞的功能产生相应的免疫应答。在香菇和灵芝等的提取物中发现了很多活性物质，香菇多糖就是其中一种重要的生物活性物质，具有免疫调节活性和抗肿瘤活性，能够调节巨噬细胞和树突状细胞的功能，通过上调巨噬细胞和树突状细胞MHC分子和协同刺激分子的表达，增强巨噬细胞和树突状细胞的成熟和活化从而发挥抗原递呈功能，同时也能够促进巨噬细胞和DC分泌细胞因子，发挥免疫调节作用和抗肿瘤作用。多糖和寡糖抗炎症反应和自身免疫性疾病方面也有很多的报道，研究发现多糖具有抗炎作用，可抑制炎症因子表达，促进抗炎因子表达等，并且能够保护机体免受免疫反应产生的损伤。鉴于多糖和寡糖的广泛生物学功能和免疫调节作用，其在药物设计和疫苗研究方面得以深入研究，发现多糖结合疫苗以及多糖佐剂具有良好的调节免疫应答效果，多糖增强乙肝病毒DNA疫苗诱导的免疫效应以及增强结核疫苗抗结核分支杆菌感染的作用。大部分多糖是一种非T细胞依赖的抗原，诱导不依赖T细胞的免疫应答，目前发现两性多糖也可通过T细胞依赖的方式诱导机体免疫应答，因此多糖或寡糖是一个良好的药物和疫苗佐剂的候选者。目前报道发现香菇多糖发挥抗肿瘤活性与其结构和分子量相关，香菇多糖主链形成三螺旋构象对于其发挥生物学功能具有重要的作用，以β-(1→6)连接为主链，β-(1→)3)连接为侧链的β寡糖是香菇多糖的基本结构单位之一，被认为是香菇多糖发挥抗肿瘤作用的重要结构，实验中发现人工合成的以β-(1→6)连接为侧链，β-(1→3)连接为主链的β寡糖及其主链含有α-(1→3)连接的β寡糖类似物和天然提取的香菇多糖具有相似的抗肿瘤作用，能够促进脾细胞的增殖和肿瘤坏死因子(TNF-α)的分泌。由于目前应用的大部分多糖都是植物或动物以及其他物种的提取物，存在结构不确定性，纯度不高以及产量较少的问题，而且实验发现合成的多糖基本结构单位和多糖具有相似的生物学效应，而且人工合成的寡糖具有结构明确，纯度高以及产量高等优点，因此人们基于这些多糖的基本结构单位人工合成寡糖并观察其生物学功能。在本实验中，顾建新教授课题组基于香菇多糖和其他β多糖的基本结构，人工合成了主链包含有一个α-(1→3)连接的，以β-(1→6)连接为侧链，β-(1→3)连接为主链的六聚体β寡糖，我们通过体外实验观察其对巨噬细胞和树突状细胞功能的影响以及对炎症因子表达的影响，并通过体内实验观察寡糖对乙肝病毒表面抗原蛋白疫苗以及核心抗原DNA疫苗诱导免疫应答的佐剂效应。第一章人工合寡糖对骨髓来源树突状细胞功能的影响鉴于树突状细胞在天然免疫应答和获得性免疫应答中的重要作用，本实验以骨髓来源的DC为细胞模型观察β寡糖的免疫调节作用。分离小鼠骨髓细胞，并在细胞因子IL-4和GM-CSF作用下分化为树突状细胞(MDC)，通过体外细胞模型观察人工合成β寡糖对DC细胞功能的影响。根据顾建新教授提供的高效液相色谱(HPLC)的数据提示β寡糖的纯度为98％以上。脂多糖(LPS)ELISA检测显示在人工合成的β寡糖中未能检测到LPS，而且β寡糖在实验使用浓度时对细胞均无毒性，100μg／ml浓度时还具有促进细胞增殖的作用。在体外使用不同浓度的β寡糖对MDC进行刺激，发现β寡糖能够促进MDC协同刺激分子如CD40，CD80，CD86等表达，并能够促进MDC成熟：在100μg／m1β寡糖作用下，CD40，CD80，CD86的表达分别为50.85％，46.19％和39.87％，而未刺激组分别为42.85％，39.78％和27.81％，在200μg／mlβ寡糖作用下还能促进MHCⅡ类分子表达(处理组46.01％和未处理组42.87％)，而且CD11c~+CD40~+或CD11c~+CD80~+或CD11c~+CD86~+或CD11c~+MHCⅡ~+细胞的数量与未处理组相比也有10％-16％不同程度的升高；并且β寡糖对HBsAg诱导的MDC的成熟也有促进作用(12％-26％的升高)，但是对MDC的吞噬能力并没有影响。成熟的DC能够迁移到局部淋巴组织诱导T细胞活化，实验进一步将β寡糖刺激后的MDC用PE-标记的CD11c抗体染色，然后将标记的细胞注射到小鼠右侧腹部皮下，24小时后检测迁移到淋巴结中标记的MDC：结果显示，右侧腹股沟淋巴结中有2.07％为迁移的MDC，但在其他部位的淋巴结中未能检测到标记的MDC。通过细胞内细胞因子染色方法检测发现β寡糖对MDC分泌细胞因子IL-10的能力无明显影响。成熟的DC可促进初始T淋巴细胞的增殖，通过混合淋巴细胞反应检测发现β寡糖能促进HBsAg诱导的MDC混合淋巴细胞增殖能力。实验结果说明β寡糖能够增强骨髓来源DC的功能。第二章人工合成寡糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞功能的影响由于巨噬细胞是天然免疫应答中的重要成员，在天然免疫应答中起着重要的免疫防御和免疫自稳作用，而且也是重要的抗原递呈细胞，因此实验检测人工合成的β寡糖对巨噬细胞RAW264.7功能的影响。通过体外用β寡糖和RAW264.7细胞共培养，48h以后发现β寡糖可促进RAW264.7细胞增殖，而且能促进RAW264.7细胞表面协同刺激分子CD40的表达，β寡糖处理组3×10~4个细胞中有8，092个细胞表达CD40，而未处理组只有6，168个细胞表达CD40分子，β寡糖能降低CD86和MHCⅠ类分子表达，但是对其他表面分子如CD80和MHCⅡ类分子的表达并无影响。活化的巨噬细胞具有很强吞噬能力，通过中性红实验以及对HRP吞噬实验发现β寡糖能够促进巨噬细胞RAW264.7对中性红和HRP的吞噬作用，未处理组细胞中性红吞噬率为317％，而联合使用β寡糖后的吞噬率为637％，是未处理组的2倍。β寡糖处理后的RAW264.7细胞HRP吞噬率为40.02，而未处理组则为30.71，β寡糖处理后明显增强RAW264.7细胞的吞噬能力。通过检测β寡糖处理后对细胞因子TNF-α分泌的影响，结果显示未处理组细胞上清中TNF-α量为260pg／ml，加入β寡糖处理后细胞上清中TNF-α量为336pg／ml。有报道表明寡糖能够通过TLR-2和TLR-4通路激活巨噬细胞，因此将RAW264.7细胞用TLR-2和TLR-4抗体阻断以后用β寡糖进行体外刺激，结果发现抗体处理后的细胞在寡糖作用下分泌细胞因子TNF-α的量明显减少，甚至低于未处理组水平，说明人工合成寡糖可能通过TLR-2和TLR-4通路激活巨噬细胞；同时实验中发β寡糖对巨噬细胞分泌细胞因子IL-10的水平无明显影响。说明β寡糖可增强小鼠巨噬细胞RAW264.7的功能，而且可能是通过TLR-2和TLR-4通路激活RAW264.7。第三章人工合成寡糖对人外周血单核细胞和HT29细胞分泌IL-18及相关因子的影响IL-18是IL1细胞因子超家族中的一员，是IFN-γ产生的主要诱导因子之一，在调节机体免疫反应中起着重要作用，可调节天然免疫应答和获得性免疫应答，而且也是一种能够在不同的免疫环境中调节Th1或Th2类免疫应答的细胞因子。以外，IL18也参与到慢性炎症反应和自身免疫性疾病当中。本实验主要观察β寡糖对人外周单核细胞和HT29细胞表达细胞因子IL-18以及相关因子的影响。在体外用β寡糖处理人外周单核细胞和HT29细胞，通过Real-time PCR检测IL-18以及相关因子的表达，结果发现β寡糖可下调细胞IL-18表达，在人外周单核细胞中寡糖处理后IL-18的比例为0.5±0.14，是未处理组的0.5倍，与HT29细胞中结果相似，β寡糖处理HT29细胞后IL-18的表达为0.58±0.08，也是未处理组的0.5倍，但是β寡糖能上调细胞IL-18BP表达，β寡糖处理后人外周单核细胞IL-18BP的表达为1.32±0.15，而未处理组为1.01±0.11；β寡糖在HT29细胞中的效果比较明显，细胞经β寡糖处理后IL-18BP的表达为2.52±0.54，是未处理组的2.5倍；而且β寡糖处理后细胞表达IL-18BP和IL-18的比例也升高，在人外周单核细胞和HT29细胞中β寡糖处理组细胞IL-18BP和IL-18的比例是未处理组的3倍和4.5倍。实验进一步检测IL-18抑制性调节因子TIR8表达，发现β寡糖可增强HT29细胞中TIR-8表达(1.74±0.16)，而未处理组为1.01±0.13，然而在人外周单核细胞中的结果与上述结果不同，β寡糖与LPS的结果相似，均能够抑制TIR-8表达。未处理组表达为1.04±0.1，而β寡糖和LPS组的表达分别为0.63±0.14和0.64±0.03。但是在实验中发现β寡糖能抑制IL-1β的作用，推测可能是影响了IL-1拮抗分子的表达，进一步检测IL-1β抑制性受体IL-1Ra的表达，结果发现IL-1β和β寡糖能够促进IL-1Ra的表达，但是β寡糖却抑制IL-1β诱导的IL-1Ra的表达，甚至低于未处理组。β寡糖发挥功能需要和相应受体相互作用，通过检测IL-18R的表达，结果发现β寡糖对IL18Rβ表达无影响，但是能促进人外周单核细胞和HT29细胞表达IL-18Rα，而未处理组均不表达IL-18Rα。第四章人工合成寡糖对乙肝病毒表面抗原诱导免疫应答的影响由于β寡糖能增强巨噬细胞和树突状细胞功能，因此我们进一步检测β寡糖对乙肝病毒表面抗原蛋白疫苗诱导免疫应答的佐剂效应。通过将β寡糖和HBsAg联合免疫小鼠，不同时间点观察β寡糖对HBsAg诱导小鼠免疫应答的影响，实验结果发现，β寡糖在初次免疫后第6天和第35天可增强HBsAg免疫后小鼠脾脏中巨噬细胞和树突状细胞的募集，在第6天HBsAg免疫后小鼠脾脏中巨噬细胞数量是PBS组的5倍，在第35天则达到8倍左右，而联合β寡糖免疫在第6天和第35天分别是PBS组的10倍和14倍。β寡糖也能促进HBsAg诱导DC细胞在脾脏中的募集，第6天和第35天都是HBsAg单独免疫组的2倍。同时β寡糖可促进DC细胞成熟和活化，通过检测DC细胞表面分子CD40，CD86和MHCⅡ类分子等表达，结果显示β寡糖联合HBsAg免疫组小鼠CD11c~+CD40~+、CD11c~+CD86~+和CD11c~+MHCⅡ~+双阳性细胞数分别为10.6×10~6、6.8×10~6和14.8×10~6，是HBsAg单独免疫组的2倍左右。活化后DC能够迁移到局部淋巴组织与T细胞相互作用，使T细胞被活化，进一步检测免疫小鼠脾脏中T细胞数量，发现β寡糖联合HBsAg免疫组第35天脾脏中CD4~+T细胞数量为29.4×10~6，明显高于HBsAg单独免疫组(17.8×10~6)，同时我们又检测了脾脏中活化的CD4~+T细胞数量，发现β寡糖不仅能增强HBsAg诱导的CD4~+T细胞增殖，同时也能增强CD4~+T细胞活化，β寡糖联合HBsAg免疫组CD4~+CD69~+T数量为11.8×10~6，显著高于HBsAg单独免疫组(6.2×10~6；P＜0.05)，但是β寡糖作为佐剂对小鼠脾脏中CD8~+T的募集和活化并没有影响。进一步检测CD4~+T细胞分泌Th1和Th2类细胞因子，发现β寡糖对HBsAg诱导的IFN-γ产生无影响，但是显著增强IL-4的分泌，β寡糖联合HBsAg组IL-4的量为30，358，是HBsAg单独免疫组的3.5倍左右，说明β寡糖可促进Th2类CD4~+T细胞功能，此类T细胞能够辅助B细胞功能，通过检测脾脏中活化的B细胞数量，发现β寡糖能显著增强HBsAg诱导的B细胞活化，在脾脏中CD19~+CD69~+细胞数达44.8×10~6，是HBsAg单独免疫组的2倍左右。B细胞能够分化为浆细胞产生抗体，通过ELISA检测抗体滴度，结果显示β寡糖显著增强HBsAg诱导的抗HBs IgG滴度，在第4周就可检测到微弱的抗体，在第8周到达高峰，以后抗体滴度逐渐下降，在高峰期抗体滴度是HBsAg单独免疫组的7倍左右，而且β寡糖主要增强抗HBs IgG1亚类抗体的产生，对抗HBs IgG2a并没有影响。HBsAg单独免疫诱导产生的抗HBs IgG1抗体滴度为1∶2700，而联合使用β寡糖免疫后显著增强HBsAg诱导的抗HBs IgG1抗体滴度(1∶4500)；而且IgG1／IgG2a比例也显著升高，是HBsAg组的2倍左右，说β寡糖能增强HBsAg诱导的Th2类免疫应答。第五章人工合成寡糖对乙肝病毒核心抗原质粒DNA诱导免疫应答的影响DNA疫苗由于能够诱导有效的病毒特异性CD8~+T细胞免疫应答成为人们研究预防和治疗性疫苗的热点，乙肝病毒核心抗原(HBcAg)含183个氨基酸，自动组装成直径为27nm由240个或180个亚单位构成的颗粒，该颗粒具有良好的免疫原性和稳定性，在体内能诱导产生依赖T细胞和不依赖T细胞的体液免疫，因此可以作为构建乙肝DNA疫苗侯选靶抗原之一。上述实验发现β寡糖可增强乙肝病毒表面抗原蛋白疫苗诱导的免疫应答，而本部分实验通过将β寡糖和表达乙型肝炎病毒核心抗原前144个氨基酸的质粒DNA(pB144)共同免疫小鼠，观察β寡糖对DNA疫苗诱导免疫应答的影响。实验结果发现，在初次免疫后第5天和加强免疫后第10天，β寡糖可促进pB144诱导DC细胞成熟，脾脏中CD11c~+CD40~+、CD11c~+CD86~+和CD11c~+MHCⅡ~+双阳性细胞数分别是pB144单独免疫组小鼠的1.5-4倍，而且小鼠脾脏，外周血和肝脏中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞数量都升高，活化的CD4~+T细胞和CD8~+T细胞数量也升高，β寡糖联合pB144组活化T细胞数量是pB144单独免疫组的1.5倍左右。通过细胞内细胞因子染色方法检测HBcAg特异性CD8~+T细胞，发现在初次免疫应答早期，β寡糖对pB144诱导的HBcAg特异性CD8~+T细胞数量无影响，但是在加强免疫后第10天，HBcAg特异性CD8~+T细胞数量在β寡糖和pB144联合免疫组明显升高，CD8~+IFN-γ~+T细胞数量为1.46×10~6，是pB144单独免疫组的1.5倍左右，而且β寡糖联合pB144免疫组CD8~+IFN-γ~+T占CD8~+T的百分比为1.5％±0.3％，是pB144免疫组的1.8左右。在外周血和肝脏中HBcAg特异性的CD8~+T细胞数量也升高，均为pB144单独免疫组的2倍左右。但是实验中发现HBeAg特异性CD8~+T细胞的数量在淋巴结中每一组均无差异。实验进一步检测抗体的滴度，发现β寡糖可增强pB144诱导的抗HBc抗体IgG滴度，在第4周和第6周均为pB144单独免疫组的3倍，而且抗体主要是抗HBc IgG2a亚类为主，寡糖联合pB144组在第4周能检测到微弱的IgG2a，而pB144单独免疫组未能检测到；寡糖联合pB144组抗体抗HBc IgG2a滴度在第6周是pB144单独免疫组的1.5倍，而抗HBc IgG1抗体基本检测不到，实验结果说明寡糖能够增强pB144质粒DNA诱导的Th1类免疫应答。