研究背景：甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH),是一种极容易上瘾的精神类药物,又称去氧麻黄碱,具有苯环结构,与儿茶酚胺类递质结构极其相似,易溶于水及酒精,其盐酸盐为透明的结晶体,状如冰,俗称“冰毒”。METH作为一种新型毒品,由于其合成技术简单、容易获得等原因,已成为世界上流行最快、滥用最为广泛的中枢兴奋剂之一。同时METH长期滥用可引起各类刑事犯罪,给社会的治安带来极大危害。因此,对METH的毒性及其防治的研究已成为世界面临的重大课题和研究热点。METH作为一种拟交感胺类兴奋剂,其药理特性主要包括中枢神经兴奋性、致幻、食欲抑制和拟交感神经能效应等。流行病学调查总结了大量的临床资料得出,METH可引起心、脑、肺、肝、肾等体内重要实质器官的损害。而在对众多器官损伤来上,其对中枢神经系统的毒性可给予人体带来严重的危害。随着研究的深入,其对中枢系统的损耗主要导致大脑黑质、纹状体、海马皮质多部位损伤,动物实验还发现可致动物大脑多巴胺能及五羟色胺能末梢损伤,包括纹状体内多巴胺(DA)含量下降,多巴胺转运体(DAT)降低,酪氨酸羟化酶(TH)活性减少,5-HT及代谢产物的耗竭,单胺囊泡转运体2 (VMAT-2)及多巴胺摄取位点缺失,导致神经元、轴索损伤,神经细胞凋亡。截至现在,METH的神经毒性机制尚未得到准确的阐明。而总结过往众多的研究结果,显示多种机制和通路参与了METH的神经毒性,包括：①多巴胺系统的紊乱导致氧化应激损伤；②谷氨酸的兴奋性作用导致Ca2+超载和细胞稳态破坏；③线粒体损伤及功能障碍；④诱导神经元凋亡等。本实验室前一阶段的研究中,PC12细胞作为细胞模型,给予METH处理后利用基因芯片技术检测凋亡相关基因的变化情况,其中caspase-11基因信号增强,并在后续Q-PCR预实验中得到了验证。作为caspase家族的一员,caspase-11在细胞凋亡、炎症和细胞迁移都扮演着重要的角色。有国外学者研究发现MPTP引起的多巴胺能神经元凋亡而引起的帕金森病,caspase-11在其中发挥着重要的作用。这跟本课题组前期的研究探索发现的METH可以引起多巴胺水平失调而出现帕金森症状可能存在相类似途径。本课题拟采用体内与体外两种实验方式对METH诱导的caspase-11表达变化进行定量分析,体内实验模型主要采用亚急性METH中毒的大鼠模型。而体外细胞模型包括PC 12细胞和SH-SY5Y细胞。除了进行定量的分析外,再通过设计特异的小干扰RNA片段以及使用caspase-11抑制剂对目的蛋白表达进行阻断,同时探究caspae-11表达变化对凋亡Maker基因,如caspase-3表达变化的影响。并通过功能学实验,如流式细胞计数,TUNEL染色,Hoechst染色等探索caspase-11的表达变化是否对METH引起细胞凋亡率也发生变化。另一方面,体内实验将选取富含多巴胺能胞体的中脑区域进行实验,首先检测caspase-11的表达变化情况以及凋亡Maker基因的表达变化情况,再通过立体定位技术定向显微注射重组病毒至大鼠中脑,从而获得特定区域caspase-11抑制大鼠模型；再给予METH刺激后,分离中脑区域,检测caspase-11的表达变化,以及检测Maker基因是否随着caspase-11的表达变化而变化。综上技术路线,探讨caspase-11发挥的作用机制,初步阐明caspase-11在METH引起的神经毒性损伤中的发挥的作用,为METH神经毒性损伤的预防和治疗提供理论基础和新的用药研究方向。目的：通过体内动物模型实验和体外两种细胞模型的实验,通过分子生物学技术联合基因沉默表达的相关技术来反复验证caspase-11以及凋亡maker基因在METH诱导后的表达变化情况,以及caspase-11与凋亡maker基因间的相互关系；并且通过功能学实验,检测caspase-11的表达变化对细胞的凋亡的影响。最终将初步阐明caspase-11在METH神经毒性损伤中的发挥的作用,为METH神经毒性损伤的预防和治疗提供一定的理论基础和新的用药研究方向。方法：1. Caspase-11在METH处理的PC12细胞和SH-SY5Y细胞的表达情况及对caspase-11基因的沉默对细胞凋亡的影响(1) CCK8法测定不同浓度的METH处理后PC12细胞和SH-SY5Y细胞的LC25,LC50。(2) Q-PCR检测小干扰RNA转染后PC12细胞caspase-11基因的表达变化。(3) Western-blot检测给予不同处理后细胞内蛋白表达变化。(4) TUNEL染色、Hoechst染色和Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪分析给予细胞不同处理后凋亡率变化。2. Caspase-11在亚急性METH中毒大鼠模型中脑区域的表达情况及慢病毒沉默caspase-11蛋白的亚急性大鼠中毒模型的建立与凋亡标记蛋白的检测(1) 亚急性中毒大鼠模型建立以及中脑区域蛋白检测。(2) 慢病毒沉默caspase-11蛋白的亚急性大鼠中毒模型的建立与相关蛋白的检测。结果：1. Caspase-11在METH处理的PC12细胞和SH-SY5Y细胞的表达上调及对caspase-11基因的沉默减少细胞凋亡。(1)PC12细胞的LC25为3.54 mmol/L; LC50为4.65 mmol/L。SH-SY5Y细胞的LC25为2.4 mmol/L; LC50为3.363 mmol/L。(表1-1)(2) 在PC12细胞中,分别给予了1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、2.5 mmol/L、3 mmol/L和3.5 mmol/L处理细胞,pro-caspase-11和cleaved-caspase-11表达量随着METH的浓度增加而升高。(图1-2)(3) 在PC12细胞中,给予3 mmol/LMETH处理细胞,分别在2h、4h、 8h、16h和24h检测pro-casp11和cleaved-casp11表达变化,可以发现蛋白表达呈现整天升高趋势,其中在16h表达量达到峰值。(图1-3)(4) 在PC12细胞中,使用了caspase-11抑制剂Wedelolactone (Wed)后发现联合使用抑制剂的METH组pro-casp11和cleaved-casp11相对于单独使用METH组来说,目的蛋白表达下降(图1-4,METH vs.WED+METH,P<0.01),同时检测的cleaved-casp3和cleaved-PARP的表达量也发现与pro-casp11和cleaved-casp11表达量变化相一致(图1-5)。关键的是,流式细胞计数、TUNEL 染色和Hoechst染色发现,相对于单独使用METH组来说,联合使用了Wedelolactone后再给予METH处理,细胞的凋亡率也随之下降(图1-6,图1-7,METH vs.WED+METH, P<0.01),这也与pro-casp11和cleaved-casp11表达量变化相一致。(5) 在PC12细胞中,通过特异siRNA片段,利用Q-PCR和western-blot技术发现siRNA片段同样能够很好地沉默caspase-11的基因表达,并且在TUNEL染色中也发现随着pro-casp11和cleaved-casp11表达量降低,METH引起的细胞凋亡也降低(图1-10,METH vs.METH+siRNA, P<0.01)。(6) 2.0 mmol/L METH作用SH-SY5Y细胞后,pro-casp11和cleaved-casp11表达量升高(图1-12,METH vs.control, P<0.05)。(7) 在SH-SY5Y细胞中,Wedelolactone同样可以很好地抑制caspase-11的表达。联合使用抑制剂的METH组pro-casp11和cleaved-casp11相对于单独使用METH组来说,目的蛋白同样表达下降(图1-13,METH vs.WED+METH, P<0.01),同时检测的cleaved-casp3和cleaved-PARP的表达量也发现与pro-casp11和cleaved-casp11表达量变化相一致(图1-14)。关键的是,流式细胞计数、TUNEL染色和Hoechst染色发现,相对于单独使用METH组来说,联合使用了Wedelolactone后再给予METH处理,细胞的凋亡率也随之下降(图1-15,图1-16,METH vs.WED+METH, P<0.01),这也与pro-casp11和cleaved-casp11表达量变化相一致,与PC12的实验结果相一致。2. Caspase-11在亚急性METH中毒大鼠模型中脑区域的表达情况及慢病毒沉默caspase-11蛋白的亚急性大鼠中毒模型的建立与凋亡标记蛋白的检测(1) 对METH亚急性中毒模型血中以及大脑中METH浓度测定发现,METH组动物的血中METH浓度为0.18-0.19ug/ml,脑中METH浓度为0.38-0.46 ug/ml,与临床报道的人体吸食冰毒后产生的血药浓度水平相差不大,并且所测的浓度下动物均能很好被诱导出现刻板运动的行为(表2-1)。(2) 在亚急性METH中毒大鼠模型中脑区域,通过免疫荧光技术(图2-2)和western-blot技术发现,caspase-11的表达量升高(图2-3,METH vs.control, P<0.01).同时对cleaved-casp3和cleaved-PARP表达量进行检测,也呈现出与caspase-11表达变化相一致的趋势(图2-3,METH vs.control, P<0.01)。(3) 定位注射的慢病毒能够很好地沉默caspase-11的表达,并且cleaved-casp3和cleaved-PARP也随之下降(图2-5,METH+LV-GFP vs.LV-shCasp11+METH, P<0.01)。结论：1. Pro-casp11和cleaved-casp11在METH处理的PC12细胞和SH-SY5Y细胞中表达显著上调,通过使用合成siRNA片段和特异caspase-11抑制剂,发现凋亡maker基因cleaved-casp3和cleaved-PARP的表达量随着Pro-casp11和cleaved-casp11表达变化而变化,说明caspase-11/caspase-3/PARP通路在METH处理细胞模型中被激活。2.在PC12细胞和SH-SY5Y细胞中,沉默了caspase-11的表达后,METH处理的细胞凋亡率也随之下降,可以初步证明caspase-11在METH诱导细胞凋亡过程中起着关键作用。3.亚急性METH中毒大鼠模型中脑区域,Pro-casp11、cleaved-casp11、 cleaved-casp3和cleaved-PARP变化趋势与体外实验的趋势一致；同时通过慢病毒立体定位注射沉默caspase-11表达后,cleaved-casp3和cleaved-PARP也随着下降,那么再一次证明caspase-11/caspase-3/PARP通路在METH处理细胞模型中被激活。