猪传染性胃肠炎病毒TH-98株N基因在大肠杆菌中的表达及重组N蛋白的纯化

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为建立对猪传染性胃肠炎快速有效的诊断方法,并试图在预防上提供有效的免疫制剂,本论文首次在我国对猪传染性胃肠炎病毒核衣壳蛋白基因进行了克隆、鉴定、表达及重组核蛋白的纯化;并在细胞上对重组核衣壳蛋白抗体的中和效力进行了测定。主要结果如下: 以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH-98强毒株基因组mRNA为模版,根据文献已发表的猪传染性胃肠炎病毒核蛋白(N)基因cDNA序列及载体pProEXHTb的多克隆酶切位点序列,设计和合成一对引物,以RT-PCR技术,扩增其N基因;将RT-PCR产物按正确的阅读框架(ORF)定向克隆到载体pProEXHTb上,重组质粒PHN转化大肠杆菌DH5α株,通过酶切分析及序列测定表明获得了TGEV N基因的无性繁殖系。经DNAStar软件进行序列分析表明:TH-98强毒株的N基因与参考毒株Purdue-115株、FS772/70株、T014株、96-1933株及TFI株的核苷酸序列的同源性分别为99%、97%、97%、95%、96%;氨基酸序列的同源性分别为99%、97%、98%、96%、97%,因此TGEV N基因具有高度的保守性。 将含有重组质粒PHN的菌株DH5α在37℃条件下培养,以浓度为0.6 mmol/L IPTG诱导,重组质粒N基因PHN融合蛋白获得了表达:经SDS-PAGE,Western-blot试验,确定其表达的融合蛋白产物大小为预期的47ku。且具有天然蛋白的抗原特异性。 根据载体pPROEXHTb含有(His)6特点,将融合蛋白进行纯化,在纯化过程中经各项条件的探索,确定为在裂解液中含有1mM PMSF的条件下,分别经过2倍体积的buffer A和buffer B洗脱后,再收集PH5.9,含有80mmol/L咪唑的1倍体积buffer C洗脱液,可得到纯化的融合蛋白。 将纯化的融合蛋白免疫家兔,制备的抗血清在猪IBRS2传代细胞上进行中和实验,结果显示中和效价为1:22,表明N蛋白所产生的抗体对TGEV的中和活性较低。
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