【摘 要】
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传统农药的长期不合理使用引起了环境和抗性等问题,创制高选择性的农药是解决这一问题的有效途径之一。几丁质酶Chi-h仅存在于鳞翅目昆虫中,并且对其生长发育关键,因此已经被证实是开发高选择性农药的理想靶标。然而,目前尚未发现该酶的选择性抑制剂。另一方面,RNA干扰（RNAi）因其独特的作用机制,本身就是开发高选择性农药的技术手段。然而,RNA农药存在口服效果差的问题。基于以上问题,本研究一方面以几丁质
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传统农药的长期不合理使用引起了环境和抗性等问题,创制高选择性的农药是解决这一问题的有效途径之一。几丁质酶Chi-h仅存在于鳞翅目昆虫中,并且对其生长发育关键,因此已经被证实是开发高选择性农药的理想靶标。然而,目前尚未发现该酶的选择性抑制剂。另一方面,RNA干扰（RNAi）因其独特的作用机制,本身就是开发高选择性农药的技术手段。然而,RNA农药存在口服效果差的问题。基于以上问题,本研究一方面以几丁质酶Of Chi-h为靶点,通过抑制剂筛选及生物活性评价,获得具有杀虫活性的高选择性抑制剂;另一方面以几丁质合酶为靶点,开发出一种适用于口服给药的候选RNA农药纳米制剂。本研究主要实验内容和结果如下:1.针对Of Chi-h的选择性抑制剂筛选。通过抑制剂筛选,确定了选择性抑制剂lynamicin B,其仅抑制Of Chi-h,对其他GH18家族几丁质酶几乎没有抑制活性。Lynamicin B对Of Chi-h的Ki值为8.76μM。Lynamicin B-Of Chi-h复合物晶体结构表明,lynamicin B的一氯吲哚基团与Trp268形成π-π堆积作用,二氯吲哚基团占据了底物结合裂缝+1和+2位点下方口袋,与口袋周围残基形成多个相互作用,这对其选择抑制活性至关重要。2.Lynamicin B生物活性研究。通过生物活性评价,发现lynamicin B可严重影响鳞翅目害虫亚洲玉米螟,草地贪夜蛾和粘虫的生长发育,具有很高的杀虫活性,死亡昆虫表现出体型瘦小,腹部萎缩的表型。通过喂食法、药膜法和浸泡法确定lynamicin B对鳞翅目昆虫天敌赤眼蜂的存活率和羽化率没有显著影响。3.基于纳米载体的RNA农药纳米制剂的制备及表征。纳米载体PEG-PLys（SH）与ds RNA的复合最佳质量比为10:1,复合物粒径为55 nm,zeta电位为21 m V,单分散分布,PDI为0.295,为球状结构。载体设计中引入的巯基交联后形成二硫键可显著提高复合物的结构稳定性。ds RNA@PEG-PLys（SH）在中肠环境中较稳定,可帮助ds RNA穿过中肠进入血淋巴从而被各组织吸收,冲洗实验表明复合物对叶片黏附能力较强。4.针对几丁质合酶的RNA农药生物活性评价。纳米载体可显著提高蝗虫口服RNAi效率,使蝗虫死亡。以中肠特异性基因Lm CHS2为靶标喂食复合物,RNAi效率约为60%。实验组若虫死亡率为20%,腹部瘦小,排便异常,围食膜呈无定形结构。以非中肠特异性基因Lm CHS1为靶标喂食复合物,RNAi效率约为50%,实验组10%若虫新旧表皮无法完全分离而死亡,15%若虫蜕皮后胫节弯曲,无法正常行走,表皮几丁质含量降低。
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