研究背景：在脊柱外科中,腰椎间盘退化性疾病是一种多发病和常见病。而在发生椎间盘退化时,会累及包括椎间盘、软骨终板、关节突及黄韧带等结构都出现不同程度的退化性改变。以往对这方面的研究多集中于对髓核与纤维环上面,血管新生在退行性腰椎间盘疾病中研究不多,随着研究的深入,血管新生在腰椎间盘退化性疾病中发挥着重要作用已经得到一致的认同,然而在血管新生起到的作用则有两种截然不同的说法,一者认为,血管新生能改善病变血运及营养是一种对病变的修复。另一说法则认为,生理状态下的椎间盘为无血供组织,而血管的侵入可能满足了基质金属蛋白酶等基质降解酶激活所需要的条件,从而导致基质的降解,椎间盘发生退变。在过去研究中发现,COX-2在组织局部缺血缺氧时表达上调,并且其上调又能通过自身途径影响新生血管的形成。本实验首先建立大鼠腰椎退变模型,研究不同类型环氧化酶2(COX-2)抑制剂对椎间盘退变模型大鼠的影响,为椎间盘退变疾病的治疗提供参考。随着人口老龄化,脊柱的退行性病变已成为脊柱外科的常见病,而腰椎间盘退变又是脊柱退行性病变中最为多发、最为常见的一个类型。临床多表现为神经根或脊髓压迫后引起的腰疼、下肢放射疼、肌力降低、皮肤感觉异常及肌肉萎缩等。研究结果显示,椎间盘的退行性改变是脊柱退行性变最先发生的部位。虽然至今为止椎间盘的这种退行性病变发生的机制仍未明确,但随着近年来分子生物学的发展,对其机制的研究已经不再局限于传统力学因素,而是从分生角度及免疫角度去探讨椎间盘退行变的成因,如细胞因子和炎症介质介导的髓核细胞凋亡、椎间盘内的蛋白多糖含量减少、新生血管的形成等都被普遍地认为在椎间盘退变的过程中发挥着十分重要的作用。新生血管形成在椎间盘退变过程中的作用,目前仍无定论,国内外许多学者认为,椎间盘中新生血管的形成是椎间盘的一种保护机制,因椎间盘内营养物质主要来自上下终板及纤维环的被动扩散,而椎间盘退变开始后,营养物质的被动扩散减弱,机体为了保证椎间盘内的营养供应及修复退变的椎间盘,椎间盘内代偿性生成血管。但是,持反对观点的学者们认为,本无血管的椎间盘内出现血管,使得椎间盘内本来无活性的基质降解酶原从血液中获得激活的因子,从而使椎间盘的细胞外基质发生降解,最终导致椎间盘发生退变。现在有椎间盘新生血管的形成和盘内蛋白多糖含量的降低及髓核细胞发生凋亡等研究学说。环氧化酶(COX)又称前列腺素内氧化酶还原酶,具有环氧化酶和过氧化氢酶活性,是一种双功能酶,目前发现其有两种同工酶：COX-1和COX-2。其中COX-2是诱导型蛋白,目前已证实其在多种恶性肿瘤内血管形成过程中起上调作用。此外,COX-2还是催化花生四烯酸转化为前列腺素类物质的限速酶。COX-2可通过多条途径促进血管生成,如：上调VEGF、bel-2表达;血栓素A2、PGE2等这些由花生四稀酸代谢而来的产物,可促进血管内皮细胞生长、迁移,诱导血管生成；此外,COX-2还可以抑制血管的内皮细胞发生凋亡。应用选择性的COX-2抑制剂可显著地抑制肿瘤内的血管生成。正常的椎间盘内无血管生成,而退变的椎间盘新生血管则较常见。同时,许多研究证实COX-2因子在退变的椎间盘内表达较正常椎问盘内表达明显增高。缺氧诱导因子1α (HIF-1α)是一种氧依赖转录激活因子,通过与低氧反应元件(HRE)结合,引发下游基因的转录。当哺乳动物的细胞中出现缺氧时,其可诱导机体产生适应性反应,是机体适应低氧环境的重要调节因子。椎间盘发生退变时,营养物质通过终板与纤维环的能力就显著降低,造成椎间盘内部相对缺氧环境,近年来研究表明退变的椎间盘内HIF-1α表达较正常椎间盘内明显增高,并且不同的缺氧程度,表达情况不同。由于肿瘤组织生长十分迅速,其生长速度超过血管生成速度,使其形成局部缺氧环境,诱导HIF-1α表达。研究已经证实,在肿瘤内HIF-lα参与血管形成的全过程：(1)启动阶段,其能通过合成一氧化氮使血管舒张,上调血管内皮生长因子及其配体的表达,使血管的通透性增加；(2)进展阶段,其能增加金属蛋白水解酶的表达,使细胞外基质降解、使血管内皮生长因子诱导血管的内皮细胞发生增生与迁徙,在血管生成素-2的作用下,形成结节状的或者锥体状的血管芽；(3)在形成阶段,其在血管内皮生长因子、血管生成素-1等的作用下,血管芽逐渐生长变形并形成血管腔,在和邻近血管芽吻合成血管网；(4)塑形与改造阶段,其也能在血管生成素-1等的作用下,使血管壁的平滑肌和其他细胞发生迁移,包绕新生成的血管,从而形成完整壁结构。研究表明COX-2、HIF-la是肿瘤内部新生血管形成的重要因子,而HIF-lα、则更是已经被证明在人类椎间盘中表达,它们在退变椎间盘组织内的表达以及与退变椎间盘内新生血管形成之间的关系,对于揭示退变椎间盘内新生血管形成的机制、及对椎间盘退变的治疗都有着重大的意义。研究目的：COX-2及HIF-lα在肿瘤内表达明显增加,并且肿瘤内血管形成密切相关。在动物退变的椎间盘中有血管形成,而且许多学者认为,椎间盘内血管形成是椎间盘退变的重要因素。同时先前研究也发现在退变的椎间盘内COX-2和HIF-lα这两种因子的表达较正常椎间盘明显增高,探讨不同类型COX-2抑制剂对椎间盘退变模型大鼠的影响,为椎间盘退变疾病的治疗提供参考。研究方法：选择12月龄SPF级SD大鼠60只,首先建立腰椎间盘退变动物模型,所有大鼠均采用6.5%水合氯醛腹腔注射麻醉,取俯卧位,固定四肢,腰背部备皮,消毒铺单,沿腰背部棘突做后正中切口,切开皮肤后沿骨膜下剥离,咬骨钳去除以L3为中心的L1-S1棘突、关节突和棘上、棘间韧带,切断双侧竖棘肌,然后逐层缝合皮下筋膜、皮肤,放入单独笼中饲养。采用简单随机法分为4组,每组15只：对照组采用安慰剂10mg·kg-1·d-1灌胃给药,塞来昔布组采用塞来昔布胶囊10mg·kg-1·d-1灌胃给药,尼美舒利组采用尼美舒利颗粒10mg·kg-1·d-1灌胃给药,双药组采用塞来昔布胶囊5mg·kg-1·d-1和尼美舒利颗粒5mg·kg-1·d-1灌胃给药,共饲喂8周。检测各组大鼠缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)表达情况,椎间盘组织蛋白多糖的水平,计算软骨细胞凋亡指数(AI)。研究结果：1对照组大鼠HIF-1α和VEGF均呈阳性表达,表现为胞质、胞核黄染,其它各组则阴性、阳性均有表达,混合用药组作用更为明显。各组大鼠HIF-1α、VEGF阳性表达情况比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。2仅使用安慰剂喂养的对照组别中,在椎间盘髓核细胞中HIF-1α出现高表达,当使用COX-2抑制剂进行干预后,HIF-1α的表达有所下降,联合用药作用更为明显。同时对VEGF蛋白的表达进行探讨,VEGF在对照组中的蛋白表达显著上升,当使用COX-2抑制剂进行干预后,VEGF表达下降,同样是联合用药作用更为明显。3对照组蛋白多糖的水平为(1.31±0.02) pg/mg,而骨细胞凋亡指数(AI)则为(43.81±2.88)；尼美舒利组为(2.06±0.06)pg/mg、(27.67±2.08)塞来昔布组为(2.19±0.10) pg/mg、(28.67±0.58)而双药组则为(2.62±0.10) pg/mg、(23.67±1.53)。可见,用药组的蛋白多糖水平明显上升,而骨细胞凋亡指数(AI)则明显下降,另外,混合用药组作用更为明显,经分析,其差异均具有统计学意义(P<0.05)。4对不同组别的椎间盘退变模型进行蛋白多糖含量的检测,发现对照组的蛋白多糖丢失最为严重,当喂养时加入了不同浓度的COX-2抑制剂后,蛋白多糖丢失相对减轻,联合用药的减轻效果更为明显；另外,通过对组织进行TUNEL染色,发现对照组出现凋亡现象最为显著,在加以COX-2抑制剂后,凋亡现象减轻,同样也是联合用药的减轻效果更为明显。研究结论：1所谓退行性变就是构成椎间盘的组织成分,在各种因素影响下出现生物化学反应,使这些组织成分在性质、数目以及形态结构方面发生变化,最终导致功能减退或丧失的现象。在椎间盘退变发生时,往往会伴有着缺氧及新生血管现象的出现。2新生血管的形成对于椎间盘退行性变有着重要的作用,而经大量研究表明,COX-2因子与新生血管的形成也密切相关。当对COX-2进行抑制时,都对椎间盘退变有着良好的治疗效果。而COX-2因子主要是通过刺激椎间盘中毛细血管增生而参与椎间盘退变的过程。3本研究结果证实,使用COX-2抑制剂对COX-2进行抑制,都可以有效缓解椎间盘退变的症状,临床效果显著。当联合COX-2抑制剂进行抑制时,治疗效果更为明显,各抑制剂之间具有一定的协同作用。4研究发现,没有使用COX-2抑制剂的组别的蛋白多糖丢失以及细胞凋亡均最为严重,当喂养时加入了不同浓度的COX-2抑制剂后,蛋白多糖丢失以及凋亡现象均相对减轻,可以推测在椎间盘退变中,蛋白多糖丢失及细胞凋亡也许是其重要的机制。