目的:人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2)是一个在乳腺癌中频繁过表达的原癌基因,是人类表皮生长因子受体家族的成员,HER2阳性乳腺肿瘤具有快速增长,高侵袭性,早期转移以及频繁的中枢神经系统转移,患者接受治疗后效果相对较差等特点。典型的治疗方法是通过抑制HER2信号通路联合化学疗法,约半数的HER2阳性肿瘤都伴随雌激素受体(estrogen receptor,ER)的表达,因此治疗方案也包括激素疗法,其中最常用的药物为ER拮抗剂他莫昔芬(tamoxifen,TAM)。膜受体HER2的酪氨酸激酶活性被激活后可导致下游一系列信号通路的活化,其中包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶点(m TOR)通路。激活的下游通路又进一步修饰和磷酸化转录因子和其他转录及细胞周期相关组件,这些过程使得这些通路对基因表达进行调节,并能提高肿瘤细胞增殖和存活能力,增强转移和血管生成能力。曲妥珠单抗是临床上针对HER2过表达乳腺癌进行治疗的典型药物,该药属于人工化的HER2单克隆抗体,通过与HER2胞外结构域结合而阻止HER2二聚化活化。该药在早期应用时有显著作用,但大部分病人会快速产生耐药性。HER2与ER在下游通路中的相互作用对乳腺癌治疗有重要影响,临床前试验和新辅助疗法试验表明在ER可以作为防御机制绕开HER2受抑制产生的影响,例如拉帕替尼靶向治疗HER2时会引起过多细胞存活相关通路的恢复,其中包括雌激素受体ER,推测可能是通过持久的PI3K/AKT通路抑制和随之发生的转录因子上调而引起ER合成增多。另有研究证明在乳腺癌激素疗法中,HER2过表达是引起他莫昔芬耐药性的原因之一,因此针对HER2及ER阳性乳腺癌的治疗方案成为研究的重点。作为传统中药,蟾酥不仅具有强心、抗炎等功效,还具有对抗实体肿瘤和白血病的作用。沙地蟾蜍素(arenobufagin,ARE)和蟾毒灵(bufalin,BU)是提取于蟾酥的两种同源蟾蜍二烯羟酸内酯类单体,具有强心甾类结构。已有现有称强心甾类物质具有抑制癌细胞增长的能力。近期研究表明沙地蟾蜍素通过抑制PI3K/AKT/m TOR通路而抑制肝癌细胞粘附、迁移和侵袭能力,诱导细胞凋亡和自噬,还能通过抑制血管内皮生长因子介导的血管生成进而阻碍肿瘤发生。许多文章也报道蟾毒灵能够引起白血病及肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等多种实体肿瘤细胞周期阻滞和细胞凋亡。本课题旨在证明沙地蟾蜍素和蟾毒灵可能成为潜在的乳腺癌辅助治疗药物。方法:(1)为揭示蟾蜍二烯羟酸内酯对HER2过表达乳腺癌的作用以及其对他莫昔芬药效的影响,我们在本课题中使用了T47D、MCF-7细胞株以及HER2基因过表达修饰的细胞株T47D/HER2和MCF-7/HER2。(2)使用MTT、克隆形成和细胞划痕实验验证沙地蟾蜍素和蟾毒灵对乳腺癌细胞生存、增殖能力及迁移能力等生物学功能的影响。(3)通过蛋白质免疫印迹技术检测乳腺癌细胞存活增殖相关的重要通路与关键蛋白的表达水平变化,包括SRCs、ERK、AKT以及凋亡相关蛋白PARP。(4)应用流式细胞术检测细胞周期的变化。结果:(1)MTT以及克隆形成实验证明沙地蟾蜍素和蟾毒灵对乳腺癌T47D和T47D/HER2细胞的存活以及增殖能力有显著抑制作用,并表明该类药物在低剂量时也能有效抑制乳腺癌细胞生长。与他莫昔芬联合用药后进行MTT的结果表明两种药物能明显提高他莫昔芬对HER2过表达乳腺癌细胞存活以及增殖能力的抑制作用。(2)蛋白免疫印迹实验结果证明沙地蟾蜍素和蟾毒灵能下调HER2的表达水平,抑制AKT和ERK的磷酸化,降低SRC-1、SRC-3和E2F1在细胞内的蛋白表达水平,凋亡标志蛋白PARP的降低以及其切割产物Cleaved-PARP的增多表明细胞凋亡水平的升高。此外该类药物还能引起三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡以及SRC-1与SRC-3表达水平的下降。(3)流式细胞术检测对细胞周期的检测结果显示在沙地蟾蜍素和蟾毒灵处理下T47D、MCF-7、T47D/HER2和MCF-7/HER2细胞的G2/M期比例显著升高,即发生G2/M期阻滞。结论:本课题证明蟾蜍二烯羟酸内酯类单体沙地蟾蜍素(ARE)与蟾毒灵(BU)能够抑制HER2阳性乳腺癌细胞的存活与增殖能力,并能显著增强他莫昔芬对HER2阳性乳腺癌细胞增殖能力的抑制作用。通过对HER2相关通路的研究,我们证明了ARE和BU能够有效降低雌激素受体共激活因子SRC-1与SRC-3的蛋白水平,并能抑制AKT与ERK的磷酸化,引起细胞周期G2/M期阻滞与细胞凋亡。还能对三阴细胞的存活产生一定影响。以上实验结论均表明沙地蟾蜍素和蟾毒灵可以作为潜在的乳腺癌治疗辅助药物。