目的:疟疾,由疟原虫经媒介按蚊叮咬传播引起的一种全球性、严重威胁人类健康的寄生虫类疾病。世界卫生组织将其与结核病、艾滋病并称为二十一世纪全球三大首要人类公共卫生问题。在全球性疾病的比例中疟疾占有很大的比重负担,目前约有2亿疟疾病例,每年约43万人死于疟疾。尽管过去15年里医学研究在消灭疟疾方面取得了相当大的进展,但是伴随着按蚊对杀虫剂抗药性的增强、疟原虫对常用抗疟药物青蒿素、氯喹等耐药性的产生以及现阶段仍缺乏高效的抗疟疫苗,使得疟疾的治疗与防控仍是目前人类面临的一项艰巨任务。脑型疟疾（cerebral malaria,CM）:凶险型疟疾临床类型的一种,最为常见,病情亦最为严重。其主要由恶行疟原虫感染所致,且为5岁以下的儿童感染疟疾的主要死因。学者们普遍认为脑疟的发生主要与患者机体内过度的炎症免疫反应相关。过度产生的炎性因子促使内皮细胞黏附分子如:CD36、CSA和ICAM-1等表达水平上调,增加了疟原虫感染的红细胞（pRBC）、血小板和淋巴细胞在微循环内的聚集,进而堵塞微循环,刺激了血管内皮细胞产生过多内皮素-1等其他物质,进而造成了脑血管收缩、脑组织乏氧。组织病理学亦证实,脑疟发生的病理基础是pRBC黏附于血管内皮细胞,滞留在深部脑血管内,引起微循环障碍。引起脑疟死亡的机制目前尚不十分清楚,有很多对脑疟发生发展的假说,但是仍无确切定论。目前CM的致死率高达10²0%,导致死亡的人数占疟疾总人数的80%,即使有幸存活下来,仍有10%²0%的幸存者留有神经系统类的后遗症。因此,更好地研究并阐明CM的发生机制,制定有效合理的预防与治疗策略是亟待解决的重要问题。关于疟疾发生过程中疟原虫对宿主作用的研究近年来有了一些新的发现。曾有研究表明,疟原虫表达或分泌的某种蛋白能够参与调节宿主的免疫应答。Fiscella等研究者发现在哺乳动物体内存在一种T细胞免疫调节蛋白（T cell immunomodulatory protein,TIP）。他们的研究证实,在宿主抗急性移植免疫模型的鼠体内,TIP能够明显抑制移植物引起的免疫排斥反应,具有类似保护作用。Nono等人研究发现在多房棘球绦虫早期的棘球蚴体内存在一种TIP同系物-EmTIP蛋白,EmTIP能够分泌到早期棘球蚴体外,参与调节宿主Th1型免疫效应。Kaczanowski等通过生物信息学方法分析比对发现,在疟原虫的基因组中存在一个与哺乳类体内TIP具有同源性较高的蛋白同系物,将其注明为假设蛋白“Q813H7”。疟原虫TIP同系物（PbTIP）在疟原虫体内的存在及其作用、功能目前尚未见报道,因此PbTIP的定位与相关研究成为了我们关注的焦点。为此,我们对疟原虫TIP的分布、定位以及能否如同哺乳类动物体内存在TIP具有的功能相同或相似而在脑疟的发生发展过程中发挥类似的免疫保护性调节作用成为我们研究的重点,旨在为CM病理损伤提供有效防治的依据,进而针对脑疟制定出更加有效的治疗策略。研究方法:1、应用生物信息学对PbTIP进行分析。Plasmodium berghei TIP（PbTIP）基因筛选于疟原虫数据库PlasmoDB。应用SMART预测分析PbTIP蛋白特性。BLAST与ClustalW进行疟原虫种属同源性alignment分析。2、P.berghei ANKA裂殖体/配子体/动合子培养与分离。裂殖体:小鼠腹腔注射pRBC,感染率达5%¹0%左右,心脏采血与裂殖体培养基混匀培养,55%Nycodenz分离液梯度密度分离。配子体:小鼠腹腔注射pRBC,小鼠感染的第4天给予小鼠饮用磺胺嘧啶饮用水,待第6天心脏采血置于48%（v/v）Nycodenz分离液中进行梯度密度分离。动合子:小鼠腹腔注射pRBC,感染第3天,心脏采血混合于动合子培养液中。62%Nycodenz分离液梯度密度分离。3、PbTIP---mRNA表达阶段的初步检测。pRBC腹腔感染BALB/c小鼠,饥饿饲养的雌性按蚊吸食鼠血液,第15、21天提取按蚊中肠（卵囊阶段）与唾液腺（子孢子阶段）保存于Trizol中。取24h和48h疟原虫感染的小鼠肝组织,保存于Trizol中。P.berghei ANKA培养与分离的裂殖体、配子体、动合子亦保存于Trizol中。Trizol法提取各样品RNA。应用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser二步法反转录试剂盒获得各样品cDNA,特异性引物RT-PCR法检测各阶段PbTIP的表达情况。4、PbTIP HA-tag型疟原虫的克隆与鉴定。依据PlasmoGEM提供的实验流程将线性化的PbTIP HA-tag进行电转,与成熟裂殖体进行基因同源重组。基因组整合了hDHFR作为药物压力选择基因,经乙胺嘧啶药物筛选获取带有hDHFR耐药型的疟原虫。PCR方法对耐药型疟原虫进行鉴定。5、PbTIP基因片段（rPbTIP）扩增与pET32a-rPbTIP表达载体的构建。小鼠腹腔注射pRBC,感染率达30%左右,提取疟原虫全虫DNA。以DNA为模板,特异性引物扩增目的片段基因,T4连接酶与经双酶切消化过的原核表达载体pET32a（+）进行连接反应,连接后的载体转入到宿主菌E.coil BL-21进行片段蛋白表达。6、rPbTIP片段蛋白表达与纯化。菌落置于LB液体培养基中,菌液OD值达到0.4-0.6时加入终浓度为1.0mM的IPTG进行诱导。诱导上清液过滤后经镍氨三乙酸琼脂糖树脂进行蛋白纯化。纯化且浓缩后的目的蛋白rPbTIP经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。7、小鼠多克隆抗血清的制备。BALA/c小鼠随机分为2组。实验组为重组片段蛋白rPbTIP免疫组,对照组为PBS组。纯化浓缩后的rPbTIP与完全弗氏佐剂混合,皮下多点注射免疫小鼠。再于第3周,第5周与不完全弗氏佐剂混合,分别给予两次加强免疫。ELISA检测多克隆免疫血清抗体滴度。8、rPbTIP免疫抗血清对分离提取的P.berghei ANKA裂殖体/配子体/动合子各期核蛋白、胞浆蛋白与膜蛋白进行Wertern Blot检测。小鼠腹腔注射pRBC,感染率约30%左右,心脏采血。血细胞置于0.17M NH4Cl中冰上裂解红细胞,Nycodenz分离液对各期虫体进行梯度密度分离,分离纯化所得各期虫体按照Invent Biotechologies蛋白分离提取试剂盒指导步骤提取各期不同组份蛋白进行Wertern Blot检测。9、应用IFA法,利用所获得rPbTIP免疫抗血清对PbTIP进行表达定位。提取血液中各阶段疟原虫,4%多聚甲醛固定。一抗为稀释后的抗rPbTIP免疫血清进行孵育,二抗加入FITC标记的山羊抗鼠IgG,DAPI核染色,OLYMPUS BX53显微镜成像仪观察,Adobe Photoshop处理图片。10、PbTIP基因敲除型伯氏疟原虫株的构建与鉴定。应用双交叉同源基因重组技术构建目的基因敲除型疟原虫株。利用hdhfr表达结构替换敲除PbTIP目的基因序列。以P.berghei基因组DNA为模板,PCR方法分别扩增3UTR和5UTR。△PbTIP打靶载体完全线性化后进行电转染,经乙胺嘧啶药物筛选获取带有hDHFR敲除型疟原虫,外周血提取基因进行△PbTIP鉴定。11、鼠脑疟模型的建立与实验分组。除正常对照组外,C57BL/6小鼠经腹腔感染pRBC后随机分为二组:一组为野生PbA感染+PBS尾静脉注射处理组（PBS组）,另一组为野生PbA感染+rPbTIP尾静脉注射处理组（rPbTIP组）。rPbTIP组每日1次,分别于第0、1、3、5、7天每日小鼠尾静脉注射rPbTIP 2mg/kg。12、小鼠血脑屏障通透性（BBB）检测。感染的第6天小鼠出现呼吸浅、体弱无力、肢体瘫痪、步态不稳、阵发性颤抖等脑疟症状,每组随机选取小鼠给予尾静脉注射伊文思蓝染料。1h后麻醉小鼠,生理盐水心脏灌注后取出小鼠脑组织浸入到甲酰胺液体中,630nm分光光度计下检测上清液中Evens blus含量。13、免疫组化与HE染色。小鼠在感染第6天出现脑疟症状。每组随机选取小鼠,取脑组织进行组织学检查。脑组织切片用于苏木精-伊红（HE）染色及黏附因子ICAM-1、VCAM-1、CD36抗体组化染色。观察鼠脑疟模型中脑组织微血管阻塞与渗漏情况。14、RNA提取及real time-PCR方法对两组细胞因子水平的检测比较。感染第0、3、5、7天随机选取每组小鼠,无菌条件下取出小鼠脾脏与脑组织,传统Trizol法提取RNA。应用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser二步法反转录试剂盒获得各样品cDNA。上述cDNA为模板,各特异性引物进行real-time-PCR反应,比较PBS组与rPbTIP组脑组织内VCAM-1、ICAM-1和CD36与脾脏内CXCL9,CXCL10和CXCR3的RNA表达差异。15、脾细胞培养。在感染第0、3、5、7天随机取出每组小鼠,无菌条件下取出小鼠脾脏。筛网研磨小鼠脾组织制备细胞悬液获取脾细胞,终浓度调整为10⁷/mL,于24孔细胞培养板中培养备用。16、ELISA法检测脾细胞培养上清与血清中细胞因子的表达水平。分别在感染第0、3、5、7天随机选取每组小鼠,无菌条件下心脏采血,离心取血清。R&D Systems ELISA试剂盒分别检测已收集的脾细胞上清培养液与血清中IFN-γ,TNF-α,IL-1,IL-12,IL-10和TGF-?细胞因子的表达水平。17、流式细胞检测。在感染的第0、3、5、7天,每组随机选取小鼠,无菌条件下取出小鼠脾脏,筛网研磨小鼠脾组织,悬浮脾细胞,计数细胞浓度,调整脾细胞终浓度为10⁷/mL。待测细胞进行特异性抗体染色,每管流式管中加入4%多聚甲醛固定上机待测。18、统计方法。数据结果使用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析,计算各组数据均值±标准误。组间组内差异采用独立样本t检验方法或单因素方差分析。各组生存差异性分析采用Kaplan-Meier long-rank检验方法,P<0.05具有统计学差异。研究结果:1、PbTIP生物信息学分析。依据疟原虫数据库PlasmoDB结果显示,疟原虫TIP（PbTIP）,ID:PBANKA₁24360,基因位于12号染色体上,由703个氨基酸编码蛋白,分子量大小80.4kDa,为一类保守型疟原虫蛋白,目前功能未知。应用生物信息学分析PbTIP在N端有一小段信号肽,并且分别在N,C两端均存在跨膜区。Pfam数据库分析可知,PbTIP属于蛋白质家族PF13517（家族:VCBS）。PbTIP 204-335aa片段结构域在其他物种中也存在。该区域约有100个残基,存在于多个弧菌、Colwellia、慢根瘤菌和Shewanella等其他几种细菌的蛋白中,综合其他物种蛋白大小、重复拷贝数,分布以及蛋白活性提示,PbTIP 204-335aa区域可能具有类似的某种粘附作用,生物信息学分析为后期PbTIP蛋白验证及片段筛选提供了依据。2、PbTIP—mRNA表达水平的检测。提取pRBCs感染小鼠24h、48h的肝组织,疟原虫裂殖体、配子体、动合子及第15天、21天从感染按蚊卵囊阶段与唾液腺子孢子阶段提取的RNA,反转录的cDNA经PbTIP特异性引物扩增。结果发现PbTIP在上述各阶段中mRNA均有表达,说明PbTIP即可以表达在宿主的红外期与红内期,也可表达在传播媒介按蚊体内。可见PbTIP能够存在于疟原虫的整个生活史。3、rPbTIP片段载体构建与片段蛋白表达纯化。成功扩增出rPbTIP片段基因,与Genebank中公布的序列进行比对结果相同。构建的pET32a（+）-rPbTIP载体经过BamHⅠ,XhoⅠ双酶切后进行琼脂糖电泳鉴定,与预期一致,说明rPbTIP片段蛋白载体构建成功。含有pET32a（+）-rPbTIP载体的E.coil BL-21菌株来表达rPbTIP重组蛋白,蛋白经His-tag镍氨三乙酸琼脂糖纯化,样品经SDS-PAGE电泳在35kDa位置处可见清晰的目的条带,蛋白纯度大于85%,浓度约1mg/mL。片段蛋白经SDS-PAGE电泳和抗His标签抗体Western blot检测,均在35kDa位置呈现清晰的免疫印迹条带,结果证实rPbTIP蛋白表达成功。4、rPbTIP多抗血清的获取与其特异性检测。重组蛋白rPbTIP免疫SPF级6-8周龄雌性BALB/c小鼠,获取多克隆免疫抗血清。ELISA结果显示,初次免疫后第2周小鼠体内血清特异性抗体有显著的升高。随后的两次加强免疫,抗体达到峰值且始终维持在较高水平上。5、Wertern Blot-PbTIP蛋白表达鉴定。获得的裂殖体、配子体、动合子各期核蛋白,胞浆蛋白与膜蛋白30μg/孔上样。rPbTIP多抗免疫血清为抗体与转有疟原虫各阶段不同组份蛋白的PVDF膜进行Wertern Blot反应,结果显示仅膜蛋白在80kDa处有清晰可见的免疫印迹条带。6、IFA-PbTIP检测。利用所获得的的rPbTIP免疫血清对野生疟原虫体内PbTIP不同阶段的疟原虫进行定位,经FITC荧光抗体标记,DAPI染核,结果可见各期疟原虫均在膜表面呈现绿色荧光,与Wertern Blot结果一致,说明PbTIP为伯氏疟原虫表达的一类特异性膜表面蛋白。7、鼠脑型疟疾模型rPbTIP组中脑组织的免疫病理损伤减弱。实验研究比较了PBS,rPbTIP两组第6天小鼠脑组织的病理变化与粘附分子VCAM-1、ICAM-1和CD36表达水平的差异。与PBS组相比,rPbTIP组中作为血脑屏障渗漏的伊文思蓝染料指示剂渗出程度较低,完整脑组织颜色较浅,对照PBS组中脑组织则颜色较深,说明rPbTIP在保护了小鼠血脑屏障的完整性上能够发挥作用。同时可见rPbTIP组每个视野内白细胞沉积的血管数量明显低于PBS组,P<0.05。此外,rPbTIP组脑微血管内皮细胞上相应的粘附分子VCAM-1、ICAM-1和CD36免疫组化统计学分析结果可知,其表达量均降低,P<0.05。rPbTIP组内脑组织VCAM-1、ICAM-1和CD36与脾脏CXCL9,CXCL10和CXCR3的mRNA表达水平同样相应的减弱,P<0.05。8、鼠脑型疟疾模型rPbTIP组内P.berghei感染C57BL/6小鼠的CM发生率降低。PBS组小鼠于第6¹2天死亡,但rPbTIP处理组小鼠疟原虫血症水平相对较低,仅有不到30%的小鼠死于ECM,其余小鼠多死亡在感染后第12天且主要死于贫血。9、鼠脑型疟疾模型rPbTIP组研究发现,T细胞介导促炎细胞因子释放减少。比较了PBS与rPbTIP两组中IFN-γ、TNF-α、IL-1和IL-12血清浓度,脾细胞培养上清浓度及脾组织中促炎细胞因子mRNA表达量的变化。与PBS组相比,rPbTIP组中IFN-γ、TNF-α、IL-1和IL-12细胞因子血清浓度、脾细胞培养上清浓度和mRNA表达水平均明显降低。10、鼠脑型疟疾模型rPbTIP组中Tregs与抗炎症细胞因子IL-10/TGF-?的表达增多。与PBS组相比,rPbTIP组中血清和脾细胞培养上清中IL-10和TGF-?表达量增多。脾细胞流式术检测,rPbTIP组中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞绝对值和百分比明显高于PBS组。结论:1、PbTIP是伯氏疟原虫表达的一类特异性膜表面蛋白。2、鼠脑型疟疾模型rPbTIP组可见脑组织免疫病理损伤减少,血脑屏障完整性增强。3、鼠脑型疟疾模型经rPbTIP处理后缓解了ECM的高发生率。4、鼠脑型疟疾模型经rPbTIP处理后可见Th1细胞介导的过度免疫反应释放的促炎因子有所减少。5、鼠脑型疟疾模型经rPbTIP处理后可见Tregs与抗炎症细胞因子IL-10/TGF-?的表达水平提高。