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目的： 溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种由免疫调节功能紊乱引起的胃肠道炎症,其在临床上主要有持续性腹泻、腹痛、血便、里急后重等症状.UC长期以来是存在于发达国家的常见病,但由于其在中国等发展中国家的发病率逐年上升,UC被认为是一种全球性疾病.该病由于发病隐匿、间断复发、难以根治等特点,被世界卫生组织列为现代难治病之一.更值得关注的是,随着患病时间的延长,迁延难愈的结肠炎很有可能转变为结肠癌.目前,虽然治疗UC的常规药物延长了许多患者的生命,提高了他们的生活质量,但这些药物并不完美,不能彻底治愈疾病且常伴有副作用的发生,因此需要有效、安全的新药来代替.最新研究证实,生长分化因子11(Growth differentiation factor11,GDF11)对动脉粥样硬化和阿尔茨海默病的小鼠模型有抗炎效果,但GDF11对UC的调控作用尚未有文献报道.因此,我们利用CHO-K1表达系统获得GDF11-Fc融合蛋白,检测该蛋白能否对小鼠实验性UC模型起到减轻效果,并在机制上进一步探讨GDF11是如何发挥保护作用的. 方法： 1.采用CHO-K1细胞表达系统,构建含编码GDF11C端成熟肽的表达载体pGS-GDF11-Fc,筛选出高分泌GDF11-Fc重组蛋白的CHO-K1稳定细胞株.根据Fc标签的特性,采用HiTrap Protein A HP柱对扩大培养后的细胞上清进行蛋白纯化.SDS-PAGE电泳后,经考马斯亮蓝染色和灰度分析,检测纯化后GDF11-Fc重组蛋白的纯度.用抗GDF11和Fc抗体对纯化后的蛋白进行Western blot检测,初步鉴定是否为GDF11-Fc目的蛋白.用GDF11-Fc重组蛋白和PeproTech公司的GDF11蛋白对hs68细胞进行处理,采用Western blot方法分析Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)的表达量,从而验证GDF11-Fc的生物学活性. 2.采用葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium,DSS)诱导的急性UC小鼠模型,评价GDF11-Fc重组蛋白是否对UC具有保护作用.建模期间每日观察小鼠的体重变化、粪便出血情况、粪便连贯性情况,并计算疾病活动指数(Disease activity index,DAI).小鼠处死后,测量结肠长度,HE分析结肠组织的病理学变化.采用流式细胞术分析小鼠血液、淋巴结、脾脏中巨噬细胞的水平,并用IHC方法检测结肠组织中巨噬细胞的浸润情况.采用qPCR方法检测结肠组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1的变化水平. 3.采用ELISA和Western blot方法,检测血清和结肠组织中IL-1β在蛋白水平上的变化.为了能增加GDF11效果的可信度和便于其他研究人员的重复,在后续探讨作用机制时采用PeproTech公司的GDF11蛋白进行相关的细胞试验.采用qPCR方法在LPS刺激的RAW264.7细胞中验证GDF11对炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的作用.采用ELISA和Western blot方法在LPS刺激的RAW264.7和BMDM细胞中验证IL-1β的分泌水平.采用qPCR和Western blot方法检测UC模型结肠组织和LPS刺激的RAW264.7细胞中的NLRP3炎症小体的活化情况,如NLRP3、caspase-1的mRNA水平及蛋白水平.在LPS刺激的RAW264.7细胞中,利用Western blot和qPCR方法检测NLRP3炎症小体活化的第一信号TLR4/NF-κB p65通路.用流式、Westernblot和Immunofluorescence(IF)方法对NLRP3炎症小体活化的第二信号ROS及其调控蛋白UCP2的水平进行检测.在LPS刺激的RAW264.7细胞中,采用Western blot方法检测GDF11下游信号通路(Smad2/3和non-Smad2/3通路)的变化.GDF11和Smad2/3通路抑制剂SB431542联合使用后,检测Smad2/3和non-Smad2/3通路的变化、IL-1β的分泌水平、ROS和UCP2水平、NLRP3炎症小体的活化水平. 结果： 1.筛选出一株生长状态较好、且高分泌GDF11-Fc重组蛋白的CHO-K1亚克隆细胞株.纯化后的GDF11-Fc蛋白纯度在90%以上,分子量与预期设计一致.Western blot数据显示,GDF11-Fc重组蛋白分别与抗GDF11抗体和Fc抗体发生抗原-抗体反应,可被确定为目的蛋白.用自制的GDF11-Fc蛋白和PeproTech公司的GDF11蛋白对hs68细胞进行处理,均使COLⅠ的表达量上升,联合SB431542抑制剂使用均可降低COL I的表达量,说明GDF11-Fc蛋白能在细胞内发挥生物学活性. 2.在DSS诱导的小鼠急性UC模型中,GDF11-Fc可显著降低DAI评分,主要是减轻体重下降和血便症状,对腹泻则没有明显的改善作用.GDF11-Fc可明显缓解结肠缩短的症状,降低结肠组织的病理学评分.DSS处理小鼠后可导致血液、脾脏、肠系膜淋巴结中M1型巨噬细胞水平显著升高,而M2型巨噬细胞则显著下降.GDF11-Fc治疗后可明显降低这些部位的M1型巨噬细胞,但对M2型巨噬细胞没有改善作用.在结肠组织中,DSS模型组有大量的巨噬细胞浸润,而GDF11-Fc治疗后巨噬细胞则明显减少.另外,GDF11-Fc可显著降低UC模型结肠组织中炎症因子的mRNA水平,如IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1. 3.在LPS刺激的RAW264.7细胞中,GDF11可下调IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平.在DSS诱导的小鼠UC模型和LPS刺激的RAW264.7、BMDM细胞中,GDF11可降低IL-1β的分泌水平.在DSS诱导的小鼠UC模型和LPS刺激的RAW264.7细胞中,GDF11可下调NLRP3、caspase-1的mRNA水平,并显著降低NLRP3、活化型caspase-1p20的蛋白水平.在RAW264.7细胞中,GDF11能够下调由LPS激活的TLR4表达水平、p65磷酸化水平、ROS的生成,并使UCP2的水平显著升高.GDF11可上调Smad2/3经典通路中Smad2的磷酸化水平,同时能够下调p38的磷酸化水平,而对ERK和JNK的磷酸化无影响.用SB431542抑制剂阻断后,GDF11对NLRP3炎症小体的负调控作用消失,如IL-1β的分泌水平,NLRP3和caspase-1p20的表达水平,ROS的生成均有所升高,而UCP2的含量明显下降. 结论： 1.初步建立了表达外源蛋白的CHO-K1真核表达系统;利用该系统所制备的GDF11-Fc蛋白具有较高的纯度和较好的生物活性,可满足后续试验的要求. 2.GDF11对DSS诱导的实验性UC模型有保护作用,能明显改善体重下降程度及粪便便血状况、降低结肠缩短的程度及结肠组织病理学评分、抑制体内巨噬细胞浸润、下调结肠组织中炎症因子的mRNA水平. 3.在体内GDF11可通过上调Smad2/3信号通路,抑制NLRP3炎症小体的活化和IL-1β的分泌,对DSS诱导的急性UC起到改善作用;在体外GDF11可通过增强Smad2/3信号通路,进而负调控第一信号TLR4/NF-κB p65和第二信号ROS的生成,对NLRP3炎症小体起到抑制作用.