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头颈部炎症、创伤、肿瘤侵犯或医源性损伤造成的周围性面神经损伤,引起周围性面神经麻痹,是一种影响患者面部功能,引起审美、心理、精神障碍的严重疾病。尽管临床上修复受损面神经的方法多种多样,但修复后的面神经功能恢复仍不能达到满意的效果,而且创伤后面瘫综合症(局部麻痹、联带运动以及反射异常)的频繁发生更影响了患者的生活质量。因此,修复面神经缺损、恢复面神经功能一直是耳鼻咽喉-头颈外科的研究重点。自体神经移植是临床上修复神经缺损的金标准,它提供了一个富含雪旺细胞(Schwann cells, SCs)及其基底膜、神经营养因子(Neurotrophic factors, NTFs)、细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)成分以及细胞粘附分子(Cell adhesion molecules, CAMs)的理想神经支架,有利于神经再生和功能恢复。然而,因供体神经来源有限以及供区并发症等缺点使其临床应用受到极大程度的限制,寻找替代传统自体神经移植的修复方法迫在眉睫。现今,利用神经导管(Nerve guidance conduits, NGC)修复神经缺损的套管技术引起了再生医学和组织工程学家的极大注意。为获得较好的再第一部分:种子细胞的获得目的:获得足够数量自体来源的种子细胞用于面神经缺损的修复,包括ADSCs, dADSCs以及SCs。方法:选用60只出生后5周的SD雌鼠(100～120g)随机分为6组。对动脉-ADSCs组和动脉-dADSCs组大鼠内脏脂肪组织进行消化、分离并培养ADSCs,传代3～5次后通过流式细胞检测其表面标志物对其进行鉴定;动脉-dADSCs组的3～5代ADSCs用胶质细胞因子混合液进行诱导以获得dADSCs;对动脉-SCs组大鼠的坐骨神经进行体内预变性处理,消化、分离并纯化SCs;行免疫荧光法对dADSCs和SCs进行雪旺细胞标志物S-100β和GFAP鉴定;通过PKH26荧光染料对dADSCs进行细胞标记以便于体内示踪。结果:培养的3～5代ADSCs经流式细胞检测其表面标志物CD29、CD44和CD90表达呈阳性,CD14、CD34和CD45表达呈阴性;在整个诱导过程中,ADSCs逐渐转变为双极或三级、纺锤形的雪旺样细胞(dADSCs)并保持细胞增殖,在形态上与未分化ADSCs有明显的区别,并且和SCs一样表达雪旺细胞标志物S-100β和GFAP;dADSCs经PKH26标记,细胞活力良好,其胞质显示均匀强度的红色荧光。结论:ADSCs发生转分化后,dADSCs在细胞形态和细胞表型上与SCs具有十分相似的特点,可作为自体细胞移植促进损伤面神经修复的种子细胞。第二部分:同种异体去细胞动脉导管的制备目的:制备大鼠同种异体去细胞动脉导管用于面神经缺损修复。方法:SD大鼠(150g)的腹主动脉经改良的脱细胞处理制备同种异体去细胞动脉导管,随后对处理好的导管进行化学交联。行H&E染色以及扫描电镜检测材料的脱细胞程度;行体外降解实验以评价其生物降解性;检测其细胞毒性和细胞凋亡效应,贴附细胞的形态学和增殖活性,以及体内移植物免疫反应和淋巴细胞体外增殖等免疫耐受性检测,以评价其生物相容性。结果:经脱细胞处理制备的同种异体去细胞动脉导管完整保留了细胞外基质胶原纤维且不含任何细胞成分,经过化学交联的去细胞动脉的降解速率低于未经过化学交联的去细胞动脉。通过材料细胞毒性和凋亡检测提示本材料对ADSCs的细胞增殖和凋亡并无明显的影响;细胞贴附检测提示本材料具有良好的细胞相容性;免疫耐受性检测提示本材料具有较好的组织相容性。结论:制备的大鼠同种异体去细胞腹主动脉导管具有良好的生物相容性、生物降解性、渗透性和一定的机械强度,可作为面神经缺损修复的理想支架材料。第三部分:ADSCs-复合去细胞动脉导管对大鼠面神经缺损的修复目的:对自体转分化ADSCs-同种异体去细胞动脉导管复合体对大鼠面神经缺损修复的作用进行评价。方法:大鼠麻醉后,建立左侧面神经颊支8-mm缺损;动脉导管组(1)、动脉-ADSCs组(2)、动脉-dADSCs组(3)、动脉-SCs组(4)以及自体神经组(5),大鼠的面神经缺损分别通过去细胞动脉导管复合无细胞培养基、自体ADSCs、PKH26标记自体dADSCs、自体SCs,以及通过自体神经进行桥接修复;假手术组(6)仅分离相应神经并使其保持完整。手术后8周,比较各手术组单侧触须运动功能,面神经颊支神经肌肉复合动作电位,面神经颊支运动神经元核团逆行示踪,再生面神经颊支形态学的情况,以及对标记的自体dADSCs进行形态学示踪。结果:术后各组动物均存活并且未发生严重的术后并发症,所有面部伤口自行愈合且无不适迹象;各手术修复组(1～5)动物的动脉导管与宿主组织相容性良好,有部分被吸收但无神经瘤的形成和明显脱离。通过比较各组单侧触须运动功能,再生颊支神经肌肉复合动作电位以及颊支运动神经元核团逆行示踪的情况,自体神经组(5)的恢复情况最佳,动脉-dADSCs组(3)的恢复情况要优于动脉导管组(1)和动脉-ADSCs组(2),稍劣于动脉-SCs组(4)以及自体神经组(5);通过再生面神经颊支形态学分析,有髓神经纤维密度以动脉-dADSCs组(3)最高,有髓神经纤维直径和髓鞘厚度以自体神经组(5)最高,轴突-纤维直径比值(G值)在各组之间无明显统计学差异;动脉导管组(1)各项参数均最差,假手术组(6)所有参数均保持正常水平。对移植物中自体的dADSCs进行免疫荧光示踪,发现部分PKH26标记的细胞同时表达SCs标志物GFAP,形成条索样结构并围绕Tubulinβ-III阳性的再生轴突。结论:在本实验中我们建立大鼠左侧面神经颊支8-mm缺损的方法可行,且假手术处理对正常神经结构和功能不具有任何损伤;在修复离断面神经的过程中,去细胞动脉导管作为一个无免疫原性的支架承载管腔内髓鞘形成细胞并支持引导再生轴突,部分移植入去细胞动脉导管的自体dADSCs很好地保持了获得的SCs显型且具有髓鞘形成能力,参与了面神经轴突再生以及髓鞘形成过程。自体转分化脂肪源性间充质干细胞-同种异体去细胞动脉复合体对缺损神经的再生修复有一定的促进作用,并且为周围性面神经损伤的修复提供了一种新的方法。