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背景及目的三阴性乳腺癌患者约占乳腺癌人群的10%-16%。其总体临床病理特征是:肿瘤体积较大,组织学分级较高,较非三阴性乳腺癌患者无瘤生存率和总生存率均显著降低;与其他类型乳腺癌相比,亦较早发生局部复发和远处转移,但其机制尚不明确。近来,微小RNA(micro RNA,miRNA)由于其在调控基因表达方面的重要作用,成为新的研究热点。miRNAs广泛表达于各个物种和组织中,并在很多生理病理过程中,如细胞发育、分化、增殖、凋亡和代谢以及肿瘤发生发展和肿瘤转移中均扮演了重要角色,然而,miRNA-136对三阴乳腺癌的侵袭和转移过程的作用机制研究甚少。本研究在组织、细胞、动物模型三个层面中检测miRNA-136的表达及其对三阴乳腺癌恶性生物学行为的影响,同时还验证了三阴乳腺癌中miRNA-136与其靶基因RASAL2协同的致癌作用,为将来合理治疗三阴乳腺癌提供新的生物学靶点。方法(1)提取三阴乳腺癌组织及正常乳腺组织、人正常乳腺上皮细胞系MCF10A和3种具有不同侵袭性乳腺癌细胞株(MCF7,ZR751,MAD-MB-231)总RNA,采用real time PCR检测miRNA-136在中的表达,并分析其意义。(2)以三阴乳腺癌细胞系MAD-MB-231为研究对象,利用脂质体转染术将miRNA-136mimic转入细胞内,检测过表达miRNA-136对乳腺癌细胞侵袭迁移能力的影响。同时利用免疫荧光、Westernblot及裸鼠肿瘤模型等实验方法,在体内外共同验证过表达miRNA-136对乳腺癌发生EMT现象的生物学作用。(3)利用生物信息学方法预测miRNA-136可能的靶基因,从中筛选可能参与调控乳腺癌细胞侵袭和迁移相关的潜在靶基因。构建miRNA-136mimics和miRNA-136 ASO与靶基因3’UTR野生型及突变型荧光素酶载体分别共转染乳腺癌细胞,应用双荧光素酶报告(Luciferase Reporter Assay)基因技术分析miRNA-136对靶基因的转录激活,将MAD-MB-231细胞及MCF10A细胞分别过表达miRNA-136 mimics和miRNA-136 ASO,利用RT-PCR、Westemblot对靶基因m RNA和蛋白质水平进行检测,确定miRNA-136对靶基因的调控方式。(4)收集20对新鲜三阴乳腺癌及其配对正常组织标本,采用real time PCR、Westemblot及免疫组化方法检测RASAL2的表达及意义。MCF10A及MAD-MB-231细胞分别共转染miRNA-136和RASAL2,利用real time PCR、Westemblot及细胞迁移实验来验证miRNA-136和RASAL2对三阴乳腺癌侵袭迁移能力的影响及作用机制。结果(1)miRNA-136在乳腺癌组织中的表达显著低于正常组织;3种乳腺癌细胞(MCF7,ZR751,MAD-MB-231)中miRNA-136的表达显著低于正常乳腺上皮细胞系MCF10A。(2)miRNA-136表达显著降低乳腺癌细胞的划痕愈合速度。MDA-MB-231-NC组(1±0.07)和转染组(0.51±0.11)细胞计数统计结果相比较,miRNA-136的表达显著降低了MDA-MB-231细胞的迁移能力(*P<0.05)。MDA-MB-231-转染组(0.54±0.14)与MDA-MB-231-NC细胞组(1±0.06)相比,miRNA-136的表达显著降低了MDA-MB-231细胞的侵袭能力(*P<0.05)。体内体外实验,均验证miRNA-136表达能够抑制三阴乳腺癌发生EMT现象,减弱乳腺癌侵袭和迁移的能力。(3)生物信息学分析:在线数据库Target Scan、mi RBase、mi RGen Targets预测了miRNA-136的靶基因RASAL2;通过Blast数据库比对,RASAL2的3’UTR区存在与miRNA-136 5’端互相作用的序列。荧光素酶报告基因结果证实了miRNA-136与RASAL2的3’UTR区结合。(4)RASAL2在三阴乳腺癌组织中的表达显著高于正常组织,并且与三阴乳腺癌组织分级成正相关。RT-PCR、Western blot检测到miRNA-136下调RASAL2的表达。RASAL2的高表达可以逆转miRNA-136调控的抑制乳腺癌细胞侵袭的作用。结论miRNA-136表达下调高侵袭三阴乳腺癌中,并且与其病理分级相关。此外,miRNA-136能够在体外抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭以及在裸鼠体内可以抑制乳腺癌EMT的发生。并且miRNA-136的表达显著下调其靶基因RASAL2在三阴乳腺癌细胞系中的表达水平。miRNA-136可以直接调节RASAL2的表达。总之,这些结果可以验证miRNA-136能降低MDA-MB-231的迁移和侵袭的能力,这个过程可能是通过调控RASAL2基因实现的。揭示miRNA-136/RASAL2/EMT在三阴乳腺癌中的调节机制。