杜仲内生真菌的分离及其代谢产物抑菌性质研究

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内生真菌(Endophytic fungi)通常是指生长在健康植物体的根、茎及叶等组织中的细胞间隙或者细胞内一类对植物体没有明显病害的真菌,是植物微生态系统的重要组成部分。近年来研究表明,从药用植物中分离出的内生真菌能够产生和宿主植株相同或者相似的生物活性物质。内生真菌活性代谢产物为新的活性物质开发提供了宝贵的资源,具有非常广泛的应用前景。本课题从传统药用植物杜仲(Eucommia ulmoides)中分离出75株内生真菌并对其代谢产物抑菌活性进行研究。采用组织分离法,对产于江苏盐城的杜仲各组织内生真菌进行分离,共得到75株内生真菌,其中来自叶22株,茎19株,根34株,分离率分别为16.34%、21.33%和36.27%。杜仲各组织内生真菌的分布有所区别,根部组织分离得到内生真菌的内生真菌最多,这可能与根部组织的生长环境有关。对75株杜仲内生真菌代谢产物的抑菌活性进行研究,发现杜仲内生真菌的代谢产物普遍具有抑菌活性。其中,30.67%的内生真菌对E. coli有强的抑菌活性,21.34%内生真菌对B. subtilis有强的抑菌活性,17.33%的内生真菌对S. aureus有强的抑菌活性,12%的内生真菌对Sh. dysenteriae有强的抑菌活性,16%的内生真菌对S. typhimurium有强的抑菌活性。内生真菌Y18代谢产物对各类指示细菌表现出较强的抑菌活性。经形态学观察和ITS鉴定分析,内生真菌Y18为一株木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)。对内生真菌Y18的生物学特性研究表明,内生真菌Y18生长的最适温度为30oC,最适pH为7.0,最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为牛肉膏,光照作用对内生真菌Y18的生长情况影响不大。通过流式细胞仪和电导率仪检测发现经内生真菌Y18代谢产物处理后E. coli和S. aureus细胞膜均受到不同程度的破坏。处理4h后,E. coli菌液相对电导率为16.22%,PI阳性细胞的比例达到25.31%。同样,S. aureus菌液相对电导率为14.5%,PI阳性细胞的比例达到19.64%。这些都表明经过内生真菌Y18代谢产物处理后,细菌细胞膜结构受到了破坏,细胞膜选择透过性的功能受到了影响,从而影响了细菌细胞正常的生物活性。采用FT-IR光谱进一步研究处理前后细菌细胞生理活性的变化。通过对细菌全细胞红外吸收图谱进行二阶导数处理分析,发现经过内生真菌Y18代谢产物处理后细菌的细胞膜、蛋白质和核酸的特征吸收峰发生了明显的变化。E. coli全细胞蛋白结构变化主要体现在β折叠增加,α螺旋、无规卷曲、β转角结构均有降低。β折叠由处理前的34.60%增加到41.47%,无规卷曲下降最为明显,由21.80%下降到18.67%。核酸物质结构也发生了明显变化;S. aureus全细胞蛋白结构变化主要是β折叠和无规卷曲结构含量增加,β折叠由处理前的30.37%增加到34.97%,无规卷曲由处理前的23.59%增加到27.48%。β转角和α螺旋结构含量降低,其中,β转角含量由处理前的18.58%降低到16.22%,α螺旋结构含量降低最明显,由处理前的27.46%降低到21.33%。通过圆二色谱检测进一步分析发现,经过Y18内生真菌代谢产物处理后,细菌基因组DNA碱基的堆积作用减弱,结构变得更松散。对内生真菌Y18的代谢产物基本组成成分进行分析,结果显示水相中存在肽类、生物碱、皂苷、黄酮以及有机酸等物质,未检测到酚类和萜类物质,而其乙酸乙酯相中主要存在生物碱类和黄酮类物质,具体是何种物质还需要进一步研究。
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