LDMSNs纳米型抗菌肽L30的表征与抗菌活性研究

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抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)抗菌谱广,抗菌活性高且不易引起耐药性,有望成为传统抗生素替代品。实验室通过计算机设计获得的抗菌肽L30(NH2-FLPLLGGLLKSLL-COOH)抗菌谱广,抗菌活性高,尤其对多药耐药金黄色葡萄球菌。但抗菌肽L30溶解性差,生物利用度低,且易被蛋白酶降解。介孔二氧化硅纳米粒子(Mesoporous silica nanoparticles,MSNs)具有生物相容性,保护药物不被酶降解,体内循环时间长等特点,改良后得到的树枝状介孔二氧化硅(Dendritic mesoporous silica nanoparticles,DMSNs)具有较大的比表面积和孔径,有利于负载大分子量药物。脂质体(Liposomes)具有靶向性、可降低药物毒性、减少用药剂量等优点,可用作药物载体。为了提高抗菌肽L30溶解度,防止L30被蛋白酶降解,提高生物利用度,设计了脂质体-树枝状介孔二氧化硅纳米载药体系包载抗菌肽L30,最终制成LDMSNs@L30,为抗菌肽L30的开发奠定基础。对LDMSNs@L30进行表征,测定抗菌肽L30稳定性、LDMSNs@L30包封率及体外释放情况、LDMSNs@L30抗菌活性以及LDMSNs@L30治疗金黄色葡萄球菌9(cfr+)感染小鼠肺炎模型的效果,获得如下结果:(1)LDMSNs@L30的表征:Liposomes、DMSNs、LDMSNs、LDMSNs@L30粒径分别为(105.13±1.56)nm、(145.57±4.52)nm、(177.40±5.50)nm、(177.23±3.96)nm,粒径逐渐变大;Zeta电位分别为(-20.16±0.48)m V、(-28.97±0.45)m V、(-28.64±0.31)m V、(-23.16±0.18)m V,膜表面电位均为负电位;透射电镜观察,DMSNs呈树枝状分布,孔道分布均匀,Liposomes包裹后得到的LDMSNs@L30表面光滑,粒径变大,和粒径检测结果一致;红外光谱检测得出,树枝状介孔二氧化硅被Liposomes包裹后,其在1100 cm-1处的特征峰明显减小;氮气吸附实验结果显示LDMSNs@L30的比表面积和孔径明显减小。以上结果证明本实验成功制备了LDMSNs@L30。(2)LDMSNs@L30高效液相测定条件:进样量:20μL;流速:1.0 m L/min;检测波长214 nm;流动相比例:乙腈∶水=55∶45;在0~250μg/m L范围内线性关系良好,日内、日间精密度高、回收率良好,在室温、冷藏、冷冻条件下稳定性良好。在抗菌肽L30浓度为4 mg/m L时,包封率为56.13%,载药量为32.26%。LDMSNs@L30体外释放时,在p H=7.4释放介质中释放度比p H=6.8高,有利于药物在血液中作用,药物缓慢释放可以提高生物利用度。(3)LDMSNs@L30抗菌谱实验结果表明:L30对金黄色葡萄球菌9(cfr+)的MIC为3.91μg/m L,LDMSNs@L30对金黄色葡萄球菌9(cfr+)的MIC为8.77μg/m L。LDMSNs@L30在胰蛋白酶浓度为8μg/m L、10μg/m L、12μg/m L时活性明显高于抗菌肽L30。LDMSNs@L30在500μg/m L溶血率仍低于1.5%,表现出良好的生物安全性。(4)LDMSNs@L30对金黄色葡萄球菌感染小鼠肺炎的治疗作用:治疗14天后,LDMSNs@L30和阳性对照万古霉素治疗组小鼠存活率为80%,抗菌肽L30治疗组小鼠存活率为70%,感染对照组小鼠肺水肿严重,治疗组基本恢复正常,感染对照组肺部载菌量(2.47±0.27)lg CFU/g,LDMSNs@L30治疗组肺部载菌量下降为(0.98±0.08)lg CFU/g。TNF-α和IL-1β水平均在感染后显著增高,LDMSNs@L30治疗后恢复正常水平。组织切片结果显示,随着治疗时间延长,小鼠肺部组织逐步好转并趋近于正常组织,表明LDMSNs@L30对感染小鼠肺炎具有治疗作用。综上所述,本研究成功建立了LDMSNs@L30,该载药纳米粒子生物安全性高,治疗效果好,可有效提高抗菌肽L30的生物利用度,防止蛋白酶对抗菌肽L30的降解作用,所得纳米粒兼具了树枝状介孔二氧化硅和脂质体两者的优点,是一种新型抗菌肽纳米载药体系。
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