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线粒体是人类细胞中除细胞核外唯一具有基因组DNA的细胞器,线粒体DNA (mtDNA)极易受到氧化应激的损伤。氧化应激与多种病理状态密切相关,包括癌症、衰老和心血管疾病等。DNA是氧化应激损伤的重要靶分子之一,形成的DNA氧化性损伤主要经碱基切除修复(BER)进行修复。APE1和抑癌基因p53为经典的核—线粒体双定位蛋白。研究表明,在未受到任何刺激情况下,二者主要定位于细胞核,当发生氧化还原后APE1和p53均发生线粒体易位,证明二者都参与了DNA的损伤修复过程。近来研究发现,APE1/Ref-1刺激大量与癌症发病有关的转录因子的DNA结合活性,如AP-1的(Fos/Jun)、缺氧诱导因子-1A(HIF-1a)、CREB蛋白、p53等。近来发现,野生型p53蛋白是一种负调节APE1表达的调控子,通过干扰APE1的结合位点Sp-1调控其表达下调。p53抑制APE1的表达将为我们进一步探讨APE1在DNA损伤修复中的作用是否依赖p53介导的细胞凋亡途径提供一条新的研究思路。作为BER途径的重要限速酶人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)在细胞氧化应激反应中起中心作用。APE1的亚细胞定位可在某些代谢率或增殖率很高的细胞的胞质中,主要定位于线粒体和内质网(ER),且APE1的线粒体靶向定位是有先决条件的,即发生氧化应激反应后APE1会靶向定位线粒体,而定位于线粒体上p53足以引起线粒体水平上p53依赖的细胞凋亡。由于双定位的核—线粒体蛋白通常拥有一个非常规的线粒体定位序列(MTS),传统的生物信息学方法无法确定其具体位置。因此,APE1和p53的线粒体定位序列尚不清楚。具体线粒体膜易位酶与蛋白质进入线粒体密切相关,蛋白质进入线粒体必须经过两个易位接触位点,即核编码的线粒体定位前体蛋白需要与线粒体表面受体识别,然后与线粒体外膜易位酶(translocase of the outer membrane,TOM)形成复合体通道(GIP)将线粒体定位蛋白外膜上。而TOM复合体主要由Tom20、Tom22和Tom70三个亚基构成,主要负责转运内部具有信号序列的蛋白,通过外膜,进入膜间隙。每个输入受体均能结合线粒体前体蛋白,但结合特性不同。Tom20和Tom22是异二聚体受体,是转运携带裂解N-端线粒体定位序列(MTS)的典型的线粒体前体蛋白。Tom70是负责将线粒体非裂解前体蛋白向内膜转运所必须的特异受体蛋白。本课题组重点研究基于APE1和p53蛋白序列的多肽阵列设计及其MTS的筛选,旨在进一步揭示DNA损伤修复通路中二者的线粒体易位机制。本课题拟联合运用分子生物学、细胞生物学、生物化学及生物信息学的技术方法,建立肽库并利用搭建好的肽库筛选APE1和p53的MTS。首先使用分子生物学手段构建一系列的融合蛋白质粒,转化E.coli表达、纯化Tom20、Tom22和Tom70。采用每15个小肽为单位,构建APE1和p53的肽库微阵列芯片。然后通过杂交反应,确定MTS的可能的区域。根据肽库筛选的结果,拟构建相应的截短型APE1融合GFP质粒,转化Hela细胞,激光共聚焦显微镜观察,融合蛋白的亚细胞定位情况。Pull down试验进一步确定APE1和p53的亚细胞定位的准确性。寻找到特异的区域后,通过定点突变的方法,对MTS进行功能确认。这为今后鉴定p53和APE1线粒体定位序列,设计阻断多肽抑制其线粒体定位提供理论依据,为通过以p53基因介导抑制线粒体APE1的表达为靶点,对肿瘤细胞的药物敏感性提供一个潜在基因治疗方法和可行策略。主要结果如下:1.构建了线粒体外膜受体蛋白Tom20、Tom22和Tom70的三种His-10 tag重组质粒,pET19b-yTom20cd-His10、pET19b-yTom22cd-His10和pET19b- yTom70cd - His10,转化E.coli,IPTG诱导蛋白表达。2. SDS-PAGE,考马斯亮蓝R250染色确定三种蛋白的诱导,使用His标签蛋白纯化树脂(Ni-NTA Resin)纯化三种蛋白。Bradford法测定纯化后的蛋白浓度。使用HRP标记的His抗体,Western blot检测三种融合蛋白。得到纯度和浓度较高的融合蛋白,进行后续的亲和试验。3.激光共聚焦显微镜观察刺激前后APE1的亚细胞定位。结果表明:APE1主要定位在HeLa细胞的细胞核,在氧化应激或维生素K3诱导后APE1易位到线粒体。分离各组分(细胞核、线粒体、胞浆)蛋白,Western blot进一步验证了APE1的定位。4.构建APE1的肽库微阵列芯片。纯化后的三种TOM蛋白分别与APE1的肽库微阵列芯片杂交,通过Spotfinder软件提取数据,SAM3.02、Cluster3.0分析数据。结果显示,APE1与Tom20的亲和力明显强于Tom22和Tom70。主要分布在APE1的N-端和C-端的前三分之一区域,筛选出可能的MTS区域位于:峰值区域包括残基211-240,238-258,265-279以及289-312。5.三种TOM蛋白与APE1的pull down试验,进一步确认,Tom20与APE1的结合力最强。提示:APE1的线粒体易位可能通过Tom20的依赖途径。6.在本实验室成功构建了以GFP为报告基因的亚细胞定位系统。激光共聚焦显微镜观察到野生型的p53定位于细胞核中,线粒体特异蛋白转录因子A(TFAM)定位于线粒体中。表明该系统采用融合GFP以指示被融合蛋白的定位是可行的。7.同样方法构建p53的肽库微阵列芯片,三种TOM蛋白杂交后的结果表明: APE1与Tom20的亲和力明显强于Tom22和Tom70。提示p53的线粒体易位也可能通过Tom20的依赖途径。通过Spotfinder软件提取数据,SAM3.02、Cluster3.0分析数据结果,筛选出可能的MTS区域位于:351-365,358-372,365-379及372-386,为后续的试验提供支持。