目的和意义喉癌是耳鼻咽喉科常见的恶性肿瘤之一,90%以上为鳞状细胞癌,占全身恶性肿瘤的1%～5%,占头颈肿瘤的30%-50%,近年喉癌的发病率有逐年增加的趋势。美国癌症协会根据近30年的数据指出喉癌是所有恶性肿瘤五年生存率唯一未得到提高的肿瘤。除了喉癌公认的危险因素吸烟与酗酒外,有学者认为咽喉反流可能是喉癌发病的协同因素。为了有效的预防喉癌的发生,对喉癌危险因素的研究至关重要。咽喉反流(Larynghopharyngeal reflux, LPR)是指胃内容物反流至食管上括约肌以上部位,引起一系列咽喉部症状和体征的总称,研究证实咽喉反流与慢性咽喉炎、声带息肉、阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征、慢性咳嗽、小儿分泌性中耳炎等咽喉部良性疾病密切相关。近年来,咽喉反流是否参与喉癌发生和发展受到了学界越来越多的关注,部分文献报道喉癌患者中咽喉反流的发生率为54-88.7%不等,认为咽喉反流是咽喉鳞癌的独立危险因素,但也有文献不支持这个观点,围绕咽喉反流在喉癌发生和发展中的作用和意义仍有很多争论。胃蛋白酶(Pepsin)是胃食管反流物的主要成分,由胃壁主细胞分泌的胃蛋白酶原,在胃内酸性条件下自我转化而成的活性形式,它是消化系统中必不可缺的蛋白水解酶,同时也是咽喉反流中主要的侵袭成分。Pepsin可通过受体介导的胞吞作用进入咽喉黏膜细胞,储存于细胞囊泡,并运送至线粒体和高尔基体内,使线粒体变体肿胀,线粒体脊变浅,高尔基体成空泡状,损伤咽喉部粘膜细胞。同时,Pepsin亦可通过抑制咽喉黏膜细胞保护蛋白(如上皮细胞应激蛋白Sep70/Sep53,上皮表面保护性蛋白-粘蛋白Mucin等)的正常表达,加重胃酸对咽喉粘膜的损伤。Pepsin在pH2的酸性环境下活性最大,而在pH2-6.5时仍有活性可对对咽喉粘膜造成伤害。pH达到6.5以上时,Pepsin虽然处于无活性状态,但仍保留其稳定性,当周围环境pH再次因咽喉反流事件而降至酸性条件时,可再次活化,因而具有潜在的损伤力。只有当pH>8时,Pepsin才能永久性失活。Pepsin长期反复刺激可引起喉上皮损害以及结构改变,使得咽喉黏膜处于慢性炎症状态,启动天然免疫应答而释放炎症因子(如IL-1、IL-6、IL-8、活性氧类等)。既往的大量文献已证实,这些炎症因子可形成特殊微环境,不仅直接诱导正常细胞中的原癌、抑癌基因突变,使正常细胞发生癌变,还可促进肿瘤的增殖、抗凋亡、迁移、血管发生,使其发生致瘤性转化,使癌症进一步恶化。但是,Pepsin是否参与喉癌的发生发展,使喉癌进一步恶化还未有深入研究,其具体机制尚需探讨。上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)指上皮细胞在特定的生理及病理情况下向间充质细胞转化的现象,表现为上皮细胞失去极性,与周围细胞和基质间的黏附能力减小,迁移性和运动能力增强,因此,EMT可促使一些参与基底膜、细胞外基质降解和破坏的溶解酶分泌,从而破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障,便于细胞分离脱落,从而发生迁移转移,目前对EMT参与肿瘤发生发展成为研究的热点。近期有文献指出,咽喉反流可能参与EMT过程,能使EMT上皮标志物E-cadherin表达缺失以及间质标志物Vimentin的上调,认为EMT与咽喉反流严重程度相关。然而,EMT在咽喉反流与喉癌之间的作用目前国内外报道鲜有报道。那么咽喉反流及其中的主要成分Pepsin是否通过EMT参与喉癌的发生和发展过程,促进喉癌的增殖、转移等恶性进程值得进一步研究。本课题拟通过免疫组化检测Pepsin在正常喉上皮组织、声带白斑组织及喉癌组织中的表达特性,与24小时多通道腔内阻-pH(MII-pH)监测参数进行对比分析,探讨Pepsin是否参与喉癌发病,同时探讨喉癌发病中Pepsin与不同反流事件的关系和特点,以及比较组织中Pepsin免疫组化和24小时多通道腔内阻抗-pH(MII-pH)监测诊断咽喉反流阳性率；在体外实验中,我们进一步以不同浓度、不同pH的Pepsin刺激喉癌细胞,观察Pepsin对喉癌细胞生物学特性的影响及其在喉癌发生发展中所发挥的重要作用；我们利用荧光定量PCR和Western Blotting技术检测喉癌细胞在Pepsin刺激后多个上皮、间质标志物的变化情况,从而证实Pepsin是否诱导喉癌细胞发生EMT,为深入理解咽喉反流是否参与喉癌发生发展提供理论基础。材料和方法1.临床标本收集18例声带白斑组织和21例喉癌组织均取自南方医科大学南方医院因声带白斑及喉癌(T1-3N1M0)拟行手术治疗的患者,手术中取喉病变组织标本,所有患者均尚未接受放化疗治疗。16例健康喉上皮组织在南方医院耳鼻喉科门诊表麻纤维电子喉镜下取声带近室带处游离缘处组织,所有受试者要求检查前2周内无服用质子泵抑制剂、促胃肠动力药物。本研究经南方医院伦理委员会批准,所有患者及健康志愿者均自愿加入且签署参与研究的知情同意书。2.24小时多通道腔内阻抗-pH(MII-pH)监测：采用ZepHr多通道腔内阻抗-pH监测便携系统(Sandhill scientific inc,美国)及型号ZAI-BL-48E单根分叉型电极,电极直径2.3 mm,共有6个阻抗通道,分别位于LES上方3 cm、5 Cm、7 cm、9 cm以及UES下方3 cm、5 cm；2个pH监测位点分别位于LES上方5 cm和UES上方1 cm。监测电极使用前均行pH 4.0和pH 7.0校准液定标校准。监测前患者禁食水至少8 h,取卧位,经鼻插入监测导管,根据食管动力监测定位LES位置,胸前固定外置参考电极。调整ZepHr多通道腔内阻抗-pH监测便携系统开始记录咽喉反流及胃食管反流数据。告知患者注意事项,嘱其次日同一时间返回检查室(保证检查时间大约24 h),拆除仪器,结束检查。监测记录数据处理采用Bioview反流分析软件(Sandhill Scientific),输出反流波形图和反流数据报告。24小时多通道腔内阻抗-pH(MII-pH)监测结果判读：咽喉酸反流次数≥2次为咽喉反流阳性标准,DeMeester≥14.7分为胃食管反流阳性标准。3.免疫组化将石蜡切片进行脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、抗体孵育、DAB显色、复染、透明、封片等步骤进行,免疫组化的检测结果进行半定量判定。随机选取5个高倍视野,按鳞状上皮细胞或鳞状细胞癌细胞的胞浆显色深浅评分,无显色为阴性记0分,浅褐色为弱阳性记1分,棕褐色为阳性记2分,颗粒状深棕褐色为强阳性记3分；按显色组织的比例评分：显色<25%为1分,显色25%～50%为2分,显色51%～75%为3分,显色>75%为4分。根据二者的乘积将显色程度分为4级,0分为阴性记0级,1～4分为弱阳性记1级,5～8分为阳性记2级,9～12分为强阳性记3级。4.细胞培养人喉癌细胞株Hep-2,采用含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗RPMI 1640培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下传代培养。采用对数期生长的细胞用于实验。5.细胞生物学实验5.1 CCK-8细胞增殖实验将1×103个细胞接种于96孔板中,分三组,每孔体积200μl,每组5孔,同时设空白对照,三组分别加入pH7无Pepsin培养基、Pepsin 0.1mg/ml培养基和Pepsin 1mg/ml培养基,分别培养0.5h、1.5h、3h、6h、15h、24h、36h。每孔加入CCK-8溶液10μl,37℃孵育2h后终止孵育,以空白对照孔调零,酶标仪上450nm测定各孔吸光度值(OD值),以相对应OD比值表示细胞增殖能力大小。细胞存活率%=(加药细胞OD/对照细胞OD)×100%。5.2平板克隆形成实验接种100个细胞到12孔板中,每种浓度Pepsin培养基条件(pH7无Pepsin培养基、Pepsin 0.1mg/ml培养基和Pepsin lmg/ml培养基)重复3孔,保证细胞分散均匀,培养18天。出现肉眼可见的细胞克隆时,终止培养,弃去培养基,多聚甲醛固定后结晶紫染色,显微镜下计数形成的克隆数(芝50个细胞为一个克隆)。平板克隆形成率=形成克隆数/接种细胞数×100%。5.3细胞周期检测采用碘化丙锭(propidium iodide, PI)单染法检测细胞加入不同浓度Pepsin培养基(pH7无Pepsin培养基、Pepsin 0.1mg/ml培养基和Pepsin lmg/ml培养基)刺激24h后细胞周期分布。将细胞固定、Rnase A消化、PI染色后,流式细胞仪检测。5.4细胞划痕实验将密度为5×105/ml的细胞接种于6孔培养板中,不同浓度Pepsin培养基条件(pH7无Pepsin、Pepsin O.lmg/ml和Pepsin lmg/ml)分三组,用200g1无菌枪头在每个孔中迅速而轻轻地划2-3道痕。划痕后Oh、24h、48h倒置显微镜下拍照,应用ImageJ软件测量细胞向致伤区迁移的距离。5.5细胞迁移实验将细胞重悬于无血清的RPMI-1640培养基中,每个Transwell小室中加入细胞,培养板每孔加入10%胎牛血清及不同浓度Pepsin(pH7无Pepsin、Pepsin 0.1mg/ml和Pepsin lmg/ml)培养基,培养24h后取出Transwell小室,固定染色显微镜下观察穿过膜的细胞。6. Pepsin刺激喉癌发生EMT：6.1 Pepsin和EMT标志物在喉癌组织中的表达及其相关性免疫组化检测80例喉癌中EMT上皮标志物(E-cadherin)和间质标志物(Vimentin、β-catenine)的表达情况,分析其与Pepsin相关性。6.2荧光定量PCR抽提细胞和组织的总RNA和小分子RNA,逆转录成cDNA后,采用sybrgreen法进行PCR扩增,通过相对定量以2一△△Ct值测定EMT上皮标志物(E-cadherin)和间质标志物(Vimentin、β-catenine)的mRNA表达情况。6.3 Western blot抽提细胞总蛋白,采用BCA法进行蛋白浓度测定,然后10% SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、化学发光法显影,检测EMT上皮标志物(E-cadherin)和间质标志物(Vimentin、β-catenine)蛋白水平表达情况。7.统计学分析采用统计学软件SPSS 19.0进行数据处理。免疫组化强度比较中采用独立样本非参数检验方法；双变量相关分析中,对非双变量正态分布资料选择Spearman相关分析；CCK-8实验采用析因设计的方差分析,细胞周期实验、平板克隆形成实验、划痕损伤实验、细胞迁移实验、荧光定量PCR三组数据比较时采用单因素方差分析,方差齐性时,采用ANOVA,多重比较采用LSD法；方差不齐采用近似F检验Welch法,多重比较采用Dunnett T3;检验水平P<0.05有统计学意义。结果1、 声带白斑、喉癌组和正常对照组中Pepsin的表达：声带白斑、喉癌组和正常对照组中Pepsin的表达定位在鳞状上皮细胞或鳞状细胞癌细胞上,以细胞胞浆表达为主,少数可见细胞核染色。喉癌组织中Pepsin强阳性(19.05%)、阳性(28.57%)、弱阳性(33.33%)、阴性(14.29%)。声带白斑组织中Pepsin强阳性(5.56%)、阳性(38.89%)、弱阳性(50.00%)、阴性(5.56%)。正常对照组中无强阳性及阳性染色,弱阳性(31.25%)、阴性(68.75%)。Kruskal-Wallis H(K)秩和检验分析,三组间Pepsin免疫组化染色评分有统计学差异,喉癌及声带白斑组组织中Pepsin免疫组化染色强度均高于正常人群组(P<0.01)。组织中Pepsin染色与相应24小时多通道腔内阻抗-pH(MII-pH)监测参数相关性分析显示,在喉癌及声带白斑组织中,Pepsin评分与咽喉酸反流立位和总数的四项参数(包括酸反流次数、酸反流时间、酸反流时间百分比、平均酸清除时间)之间有显著的相关性(P<0.05)。Pepsin评分和所有食道酸反流参数(除去pH<4时间平卧位)之间有显著的相关性(P<0.05)。以24小时多通道腔内阻抗-pH(MII-pH)监测结果进行咽喉反流及胃食管反流事件评定,咽喉反流(咽喉探针)在喉癌组、声带白斑组及正常组三组间的阳性率(LPR+%)分别为33.33%(6/18)、23.81%(5/21)、12.5%(2/16),胃食管反流(食管探针)阳性率(GER+%)为22.22%(4/18)、33.33%(7/21)6.25%(1/16),两者诊断阳性率偏低,且数据均无统计学差异。但若以组织中Pepsin免疫组化结果为咽喉反流诊断标准,Pepsin表达水平≥弱阳性为咽喉反流阳性标准,咽喉反流阳性率(Pepsin+%)在三组间分别为94.44%(17/18)、80.95%(17/21)、31.25% (5/16),诊断阳性率明显高于24小时多通道腔内阻抗-pH(MII-pH)监测,且三组间有统计学差异。2、Pepsin促进喉癌细胞体外增殖、转移。CCK-8实验显示,加入Pepsin 0.1mg/ml及1mg/ml刺激后,喉癌Hep-2细胞分别较未加入Pepsin刺激相比体外增殖能力具有显著差异(F=455.766, P<0.001), Pepsin lmg/ml组喉癌Hep-2细胞体外增殖速度最快,Pepsin 0.1mg/ml组次之。平板克隆结果表明,加入Pepsin 0.1mg/ml和1mg/ml刺激后,喉癌Hep-2细胞分别较未加入Pepsin刺激的集落形成数增加至1.64和3.15倍,喉癌Hep-2细胞不但克隆数目显著增加,而且克隆大小也明显增加。不同Pepsin浓度组间差异具有统计学意义(F=7.696,P=0.022)。细胞周期检测实验显示,加入不同浓度Pepsin刺激喉癌Hep-2细胞24h后,随着加入胃蛋白酶的浓度升高,S期细胞比例显著增加(F=410.216,P<0.001)。细胞划痕实验结果表明,喉癌Hep-2细胞划痕后在不同浓度Pepsin(Omg/ml、 0.1mg/ml和1mg/ml)的刺激下培养24小时(F=22.406,P=0.002)、48小时(F=10.349,P=0.011),细胞的移动能力均有显著统计学差异。Transwell实验显示,Pepsin浓度的升高(F=-6.506,P<0.001),细胞运动能力的差异具有显著性。3、Pepsin诱导喉癌发生EMT：3.1 Pepsin诱导喉癌细胞株发生EMT改变：3.1.1 Pepsin对喉癌细胞株形态学影响：经不同浓度Pepsin刺激5天后,喉癌Hep2细胞株细胞形态发生了明显改变。Hep2细胞株未加入Pepsin组细胞保持原有细胞形态类圆形增殖生长,0.1mg/ml Pepsin间断刺激5天后,Hep2细胞变为梭形生长,两端伸出触角,而加入1mg/ml Pepsin的细胞株梭形化更加的明显,细胞狭长。说明Pepsin可使喉癌Hep2由上皮细胞表现向间质细胞表现转化。3.1.2 Pepsin诱导喉癌细胞株EMT标记物改变：荧光定量PCR和Western Blotting分析均显示,不同浓度Pepsin刺激后Hep2细胞后,随着胃蛋白酶浓度的增高,上皮标志物E-cadherin下调而间质标志物Vimentin、β-catenin上调。3.2Pepsin在喉癌组织中与EMT标志物相关性：经Spearman相关分析,在喉癌中Pepsin表达与E-cadherin表达呈负相关(Correlation Coefficient=-0.330, P=0.002),与Vimcntin表达呈正相关(Correlation Coefficient=0.203, P=0.041),与β-catenin表达亦呈正相关(Correlation Coefficient=0.220, P=0.038),同一组织标本连续切片后观察三个指标不同强度染色情况,可看出随着Pepsin的增强,E-cadherin减弱而Vimentin、β-catenin增强。结论1.在声带白斑、喉癌组织和正常对照组织上皮胞浆可检测到Pepsin表达,经过统计学分析后发现喉癌及声带白斑组组织中Pepsin免疫组化染色强度均高于正常人群组(P<0.01),Pepsin表达评分与咽喉酸反流立位和总数的四项参数(包括酸反流次数、酸反流时间、酸反流时间百分比、平均酸清除时间)之间有显著的正相关关系。提示咽喉反流与喉癌相关,其中pepsin起重要作用,可能是喉癌发生的危险因素之一。2.以组织中Pepsin免疫组化结果为咽喉反流诊断标准,声带白斑、喉癌组织中诊断阳性率明显高于24小时多通道腔内阻抗-pH(MII-pH)监测,且三组间有统计学差异,充分说明在非酸性条件下,胃蛋白酶依然存在于声带白斑、喉癌组织中,以24小时多通道腔内阻抗-pH(MII-pH)监测评估咽喉反流存在着一定的漏诊率, 而应用组织中的胃蛋白酶检测可以做为一项更好诊断咽喉反流指标。3.体外实验结果表明Pepsin可增强喉癌细胞体外增殖、迁移能力,说明长期的Pepsin刺激参与了喉癌的发生发展过程,与喉癌的恶性进程密切相关。4.长期的Pepsin刺激使喉癌细胞发生形态学变化,随着胃蛋白酶浓度的增高,上皮标志物E-cadherin表达下调,间质标志物Vimentin、β-catenin表达上调。在喉癌组织免疫组化中Pepsin表达与E-cadherin表达呈负相关,与Vimcntin、β-catenin表达呈正相关,提示Pepsin很可能通过EMT在喉癌细胞的形态改变及增殖、转移性生物学行为中扮演重要角色,参与喉癌的发生和发展,促进喉癌的恶性进程,其具体机制需今后的研究进一步深入探讨。