冠状病毒（Coronavirus,CoV）成员众多,可感染多种动物和人类,对畜牧业和人类的健康造成严重威胁。其中能感染猪的冠状病毒主要来自于α-CoV属和δ-CoV属,前者包括猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒等,后者主要是猪丁型冠状病毒（Porcine delta coronavirus,PDCoV）。非结构蛋白3（Nonstructural protein 3,nsp3）是冠状病毒基因组编码的最大的非结构蛋白,参与病毒复制转录复合体的形成,包含多个功能域。宏域（Macrodomain,Macro）、泛素样结构域2（Ubiquitin-like domain 2,Ubl2）和木瓜样蛋白酶（Papain-like protease,PLpro）是nsp3的三个保守功能域。Macro可结合多聚或单二磷酸腺苷核糖（Adenosine diphosphate ribose,ADPr）,参与病毒的翻译后修饰;PLpro参与非结构蛋白（Nonstructural protein,nsp）,nsp1/2-nsp4的水解释放以及病毒的免疫逃避,为冠状病毒抗病毒药物的重要靶点之一。本课题以PDCoV nsp3为研究对象,揭示了PDCoV nsp3多功能区域Macro-Ubl2-PLpro参与病毒复制和免疫逃避的结构基础,为冠状病毒复制机制和研发抗病毒药物奠定了基础。具体内容如下:1.PDCoV nsp3多功能域Macro-Ubl2-PLpro的克隆构建、蛋白表达与纯化、晶体筛选与优化利用生物信息学分析技术,通过PDCoV nsp3氨基酸序列的对比分析以及结构模拟预测,初步确定单独的Macro和联合的Ubl2-PLpro功能域,并尝试进行多种载体的克隆构建和截短构建,对蛋白的表达与纯化条件进行摸索,成功表达和纯化出Macro和Ubl2-PLpro蛋白。对Macro和Ubl2-PLpro分别进行结晶条件筛选与优化后,只得到分辨率为6.0（?）和3.7（?）的晶体。虽然我们未成功拿到Macro和Ubl2-PLpro高分辨率的晶体结构,但是我们尝试联合三个功能域,并成功表达纯化出多功能域Macro-Ubl2-PLpro蛋白,经过晶体筛选与优化后,首次得到分辨率为2.5（?）左右的冠状病毒nsp3多功能域蛋白晶体。2.首次解析δ-CoV属PDCoV nsp3多功能域Macro-Ubl2-PLpro的三维结构首次成功解析了δ-CoV属PDCoV nsp3的多功能域Macro-Ubl2-PLpro蛋白的晶体结构。Macro-Ubl2-PLpro蛋白晶体以首尾相连的二聚体形式存在,但在溶液中主要以单体形式存在。Macro-Ubl2-PLpro单体结构呈现出一个延展性的线性结构,包含三个保守的区域,分别是Macro、Ubl2和PLpro区域。Macro呈现“三明治”结构,由两边的α-helix夹着中间的6个β-stand组成;Ubl2连接Macro和PLpro,包含1个α-helix和3个β-stand,结构同源性分析发现PDCoV Ubl2的扭转方向明显偏移;PLpro呈现“伸展的右手”结构,包含拇指区域（Thumb domain）,手掌区域（Palm domain）,手指区域（Fingers domain）。氨基酸序列和结构同源性分析发现PDCoV PLpro具有与其他冠状病毒PLpro一样保守的氨基酸位点Cys260,His398和Asp412,表明其可能具有相同的生物学功能。3.PDCoV nsp3多功能域Macro-Ubl2-PLpro体外生化活性分析基于荧光共振能量转移技术,利用荧光底物DABCYL-PGFKAGSDELFI-（E-EDANS）-amide、Ubiquitin-AMC和ISG15-AMC去探索PDCoV Macro-Ubl2-PLpro野生型、截短型以及突变型的生物学功能。实验结果表明,PDCoV PLpro具有水解多肽的蛋白酶活性、去泛素化（Deubiquitinating,DUB）酶活性以及去ISG15（de ISGylating）酶活性,且Ubl2截短后其酶活性显著降低,Macro截短后其DUB活性与de ISGylating酶活性明显下降,表明这三个功能域协同发挥作用。基于氨基酸序列和结构分析设计了一系列突变体,通过体外酶活性实验确定Cys260和His398为PDCoV PLpro酶活性关键位点,而且发现loop 409-413位氨基酸（Amino acids,aa）是调节PLpro酶活性的关键基序。综上所述,本研究为了解冠状病毒的免疫逃避与复制机制提供了一定的理论基础,同时为新型抗冠状病毒药物的研究提供了新思路。