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成骨细胞是骨形成的主要功能细胞之一,成骨细胞的增殖和分化功能受到抑制时,会使骨形成减慢,骨代谢失衡,并最终导致骨质疏松。成骨细胞的功能受到多种因素的影响,包括成骨细胞内部的表观和非表观遗传学因素,以及细胞外界的一些力学刺激等。但成骨细胞响应力学刺激并启动内部信号通路的机制至今仍不明确。微管微丝交联分子(microtubule actin crosslinking factor 1,MACF1)是连接微丝和微管的细胞骨架蛋白,MACF1可以调控细胞骨架动力学,进而参与力学刺激响应、细胞信号转导、细胞迁移、以及疾病发生等生物学过程。本团队前期研究表明,MACF1在成骨细胞增殖、分化过程中起重要作用。但MACF1对成骨细胞增殖和分化的调控机制目前尚未明确。因此,本研究目的旨在阐明MACF1对成骨细胞增殖调控作用及机制;并结合MACF1相关非编码RNA,研究其对对成骨细胞分化的调控作用。为深入研究力学条件下MACF1的功能和成骨细胞增殖和分化的机制提供了理论和实验基础,并且也对寻找骨质疏松诊断和治疗的新靶点具有非常重要的意义。研究方法:本研究首先采用三维随机回转仪和小鼠尾悬吊后肢去负荷模型,检测在力学去负荷条件下MACF1在MC3T3-E1小鼠前成骨细胞以及C57BL/6小鼠股骨组织和股骨骨源间充质干细胞中的表达变化;采用MACF1高/低表达MC3T3-E1前成骨细胞模型,研究MACF1对成骨细胞碱性磷酸酶活性、细胞矿化结节生成、成骨分化相关基因表达和细胞增殖速率的影响,并结合力学去负荷条件,检测MACF1在力学去负荷条件下对β-catenin表达水平和活性的影响,以及β-catenin对成骨细胞增殖的调控作用。进一步通过对MACF1低表达前成骨细胞进行LncRNA、miRNA、mRNA表达谱基因芯片分析,结合生物信息学分析手段,筛选MACF1相关的成骨分化非编码RNA,并通过CHIP-seq和JASPAR数据库预测MACF1对筛选获得的非编码RNA的调控作用。在老龄和尾悬吊骨质疏松小鼠模型股骨组织中检测筛选获得的Lnc-DIF和miR-489-3p的表达变化。在前成骨细胞中转染Lnc-DIF-siRNA或miR-489-3p模拟物/抑制物,检测细胞的成骨分化标志基因表达水平、碱性磷酸酶活性和矿化结节生成速率、以及转染Lnc-DIF-siRNA对前成骨细胞miR-489-3p水平的变化。通过荧光原位杂交技术,检测Lnc-DIF在MC3T3-E1前成骨细胞中的分布情况。通过荧光素酶报告基因检测技术,检测了前成骨细胞中Lnc-DIF对miR-489-3p的结合作用。使用成骨细胞靶向递送系统在去卵巢骨质疏松小鼠模型中转染Lnc-DIF-siRNA,通过microCT技术检测小鼠骨微结构的变化。检测转染AK016739-siRNA后,前成骨细胞的碱性磷酸酶活性、矿化结节生成速率、以及成骨分化标志基因和成骨相关转录因子水平的表达水平。并分别采用超景深显微镜、钙黄绿素标记、免疫组化和RT-PCR方法检测去卵巢骨质疏松小鼠转染AK016739-siRNA后的颅骨厚度、骨形成速率、成骨标志因子蛋白水平和成骨相关转录因子表达变化。研究结果:(1)MACF1参与成骨细胞对力学条件的响应,调控成骨细胞功能在三维随机回转力学去负荷条件处理24和48 h后,小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中MACF1的mRNA和蛋白表达水平均降低;在28天的尾悬吊力学去负荷处理后,小鼠股骨组织中MACF1的mRNA和蛋白水平,以及股骨骨源间充质干细胞中MACF1的mRNA水平也明显下调。在MACF1高/低表达前成骨细胞中,细胞的碱性磷酸酶活性、矿化结节生成和成骨分化相关基因表达均受到MACF1的正调控,同时细胞的增殖速率和增殖细胞比率也受到MACF1的正调控。力学去负荷条件对成骨细胞增殖的抑制作用受到了MACF1表达水平的影响:MACF1低表达时力学去负荷条件对成骨细胞的增殖抑制作用较弱。此外,结果显示在MACF1高/低表达前成骨细胞中,β-catenin的mRNA与蛋白表达和β-catenin的活性也受到了MACF1的正调控;并且力学去负荷条件抑制β-catenin的mRNA表达的作用也在MACF1低表达时减弱。以siRNA干扰β-catenin表达可以抑制成骨细胞增殖,而氯化锂处理则对上述过程有恢复效果。综合分析以上结果,表明:力学去负荷条件抑制成骨细胞中的MACF1表达;MACF1参与成骨细胞响应力学去负荷条件,且正调控成骨细胞的增殖和分化;此外,MACF1对成骨细胞增殖的调控,通过β-catenin信号通路实现。(2)MACF1相关非编码RNA——Lnc-DIF及mir-489-3p的筛选及其对成骨细胞分化和骨形成的调控作用MACF1低表达前成骨细胞的lncRNA、miRNA、mRNA表达谱芯片的生物信息学分析结果显示:miR-489-3p在MACF1低表达成骨细胞中表达降低,且与成骨分化基因相关性最好,而Lnc-DIF在MACF1低表达成骨细胞中表达升高,且Lnc-DIF序列中存在多个miR-489-3p结合位点。CHIP-seq和JASPAR数据库预测结果发现了MACF1结合的转录因子在Lnc-DIF启动子区域存在结合位点,说明MACF1可能调控Lnc-DIF的转录。因此推测,MACF1通过调控Lnc-DIF表达,影响miR-489-3p对靶基因—成骨分化相关基因—的调控。在老龄和尾悬吊骨质疏松小鼠模型的股骨组织中,Lnc-DIF表达升高。在前成骨细胞中转染Lnc-DIF的siRNA可以上调成骨分化标志基因表达,并且提高细胞碱性磷酸酶活性和矿化结节生成水平。荧光原位杂交结果表明Lnc-DIF在MC3T3-E1前成骨细胞中主要分布在细胞质中;转染Lnc-DIF-siRNA可升高前成骨细胞miR-489-3p水平,通过荧光素酶报告基因检测证明了Lnc-DIF可以结合miR-489-3p。采用骨靶向递送系统经小鼠尾静脉注射Lnc-DIF的siRNA可以恢复去卵巢骨质疏松小鼠的骨微结构。miR-489-3p在老龄骨质疏松患者骨组织、以及老龄和尾悬吊骨质疏松小鼠模型股骨组织中低表达。在前成骨细胞中转转染miR-489-3p的模拟物或抑制物,分别促进/抑制成骨细胞分化。综合分析以上结果,表明:MACF1可能通过转录因子负调控Lnc-DIF,而Lnc-DIF则通过结合miR-489-3p,抑制成骨细胞分化和骨形成。(3)MACF1相关长链非编码RNAAK016739的筛选及其对成骨细胞分化和骨形成的调控作用MACF1低表达前成骨细胞的基因芯片分析结果显示,AK016739是与成骨分化基因相关性最好的长链非编码RNA。采用CHIP-seq和JASPAR数据库预测转录因子的手段验证了MACF1对其的调控作用。在MC3T3-E1前成骨细胞中转染AK016739的siRNA可以提高成骨细胞碱性磷酸酶活性和矿化结节生成水平,并且促进成骨细胞分化标志基因和成骨分化相关转录因子的表达。体内转染AK016739的siRNA可以恢复去卵巢骨质疏松小鼠的颅骨厚度、骨形成速率、成骨标志因子蛋白水平和成骨相关转录因子的表达水平。综合分析以上结果,表明:MACF1可以通过转录因子负调控AK016739,而AK016739则可以抑制成骨细胞分化和骨形成。结论:综上所述,MACF1在成骨细胞响应力学去负荷条件中扮演重要角色,并且对成骨细胞的增殖和分化功能起正调控作用。MACF1可以通过β-catenin来促进成骨细胞增殖。此外,还可以通过其下游的非编码RNA:Lnc-DIF-miR-489-3p轴和AK016739正调控成骨细胞分化和骨形成。本研究阐明了力学响应分子MACF1对成骨细胞增殖和分化的调控作用及调控机制,并且发现了新的调控成骨细胞分化的表观遗传学信号通路。本研究为阐明成骨细胞对力学去负荷条件的感知以及其对骨形成的影响提供了理论基础,同时也对骨代谢相关疾病的防治提供了新的潜在治疗靶点。