细小病毒性肠炎是犬群中一种高度接触性传染性疾病,具有很高的发病率和死亡率,在世界各地广泛分布。临床表现主要是急性出血性肠炎,呕吐,白细胞减少。自1978年首次发现犬细小病毒2型起(canine parvovirus type2, CPV-2),细小病毒快速进化,到2001年已经产生了三株抗原变异株(CPV-2a, CPV-2b, CPV-2c).关键位点氨基酸的变化引起抗原性质的改变,影响病毒与宿主细胞,组织嗜性。同原始的毒株CPV-2相比,变异株的致病性增加,宿主范围扩大,能够感染猫,引起猫发病。流行病学调查显示,变异株CPV-2c逐渐在不同地区流行,并且引起成年犬严重的疾病。目前,CPV抗原变异株已完全取代了原始的CPV-2株,并在全世界广泛流行。CPV-2弱毒疫苗的问世及其广泛应用,使得CPV-2暴发和流行情况得以控制。当前临床上使用的弱毒疫苗与灭活疫苗在免疫效果上存在各自的不足,许多国家均有犬群免疫后暴发CPV的报道。随着人们的认识不断加深,传统疫苗的局限性也日益暴露。近来,以VP2蛋白为目标的合成肽疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗和重组病毒载体疫苗的研究取得了一系列进展,其在免疫上不会受到母源抗体干扰,免疫效力等方面也均得到广泛认可。由于VP2具有较强的免疫原性,可用于制备亚单位疫苗或DNA疫苗。用杆状病毒／昆虫表达系统大量表达VP2蛋白时,体外形成的VP2蛋白能自我组装成病毒样粒子,粒子的大小和形态结构与天然病毒相似。基于这一特性,本研究利用杆状病毒／昆虫表达系统表达了犬细小病毒VP2蛋白,并且该蛋白能在体外自动组装成病毒样粒子。随后分别在豚鼠和犬两种动物模型中,通过口服和肌注两种途径免疫,对犬细小病毒样粒子的免疫原性进行评价,为将来CPV的亚单位疫苗生产提供依据。本实验主要完成了以下两部分工作。1、犬细小病毒粒子的制备与鉴定。首先以细小病毒德牧株DNA为模板,分别用两对含不同酶切位点的引物PCR扩增VP2基因,将回收后的产物连接至T载体,鉴定正确后回收目的基因产物,将该产物分别插入转移载体pFastBacDual的PpH启动子和P10启动子下,随后将该转移载体转化至大肠杆菌DH10Bac细胞中,在辅助质粒的作用下,通过蓝白斑筛选出正确的重组Bcmid质粒,用该质粒转染BmN细胞,产生重组杆状病毒。重组杆状病毒感染昆虫细胞后大量表达细小病毒VP2蛋白并组装成细小病毒样粒子。2、犬细小病毒样粒子的实验免疫研究。将转染产生的重组杆状病毒记为一代病毒(P1),随后在BmN细胞中增殖,约3天后收获病毒,产生的病毒记为二代重组病毒(P2),测定病毒滴度2.5×108pfu/ml。取5日龄蚕蛹,每只蚕蛹注射5×106pfu个重组杆状病毒,蚕蛹置于27℃培养,120h后收获蚕蛹。将蚕蛹称重并加入PBS研磨(按照1g蚕蛹加入4mlPBS的比例加入适量的PBS)。以此研磨液为免疫样品,测定其血凝效价。分别通过肌注和口服两种途径,以不同剂量的病毒样粒子免疫豚鼠,衡量病毒样粒子作为免疫原性的效果。随后通过口服途径免疫犬,衡量病毒样粒子作为口服疫苗的效果。研究发现,构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达VP2蛋白,且能够组装成病毒样粒子。重组杆状病毒注射蚕蛹后,在蚕蛹体内大量表达VP2蛋白,形成的病毒样粒子具有很高的血凝效价1：210,说明蚕蛹可用于犬细小病毒样粒子的大量表达。随后豚鼠肌注免疫实验表明,病毒样粒子具有很好的免疫原性,能够刺激机体产生血凝抑制抗体,最高可达1：299.7。豚鼠和犬的口服免疫实验则说明,病毒样粒子能够通过口服免疫途径刺激机体产生体液免疫反应,且在一定的免疫剂量范围内,免疫剂量越高,抗体水平也越高。动物免疫实验说明犬细小病毒样粒子具有很好的免疫原性,肌注和口服两种途径均能刺激机体产生体液免疫反应,且所需免疫原的剂量很低。本研究为犬细小病毒新型亚单位疫苗的制备提供了理论依据。