多花黄精微块茎的离体形态发生及相关基因的表达分析

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多花黄精(Polygonatum cyrtonema)为百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)多年生宿根草本植物,以根茎入药。本研究以多花黄精为实验材料,建立了一种微块茎形成的高效离体繁殖体系,并研究了胁迫组培对多花黄精生长发育的影响,分析了多花黄精组培苗在黑暗胁迫、盐胁迫环境下的表型,初步分析了多花黄精组培苗响应盐胁迫的转录组,探讨其在分子水平上的抗盐机理;基于多花黄精盐胁迫转录组数据和实时荧光定量PCR技术对多花黄精抗逆胁迫基因及结薯基因进行了分析验证;此外基于微块茎形成的高效离体繁殖体系建立了多花黄精工厂化育苗生产模式并进行了效益分析。主要研究结论如下:(1)本文对多花黄精组织培养部分阶段培养基进行了优化得出,多花黄精生根最优培养基为1/2MS+1mg/L NAA+0.6wt%琼脂;诱导块茎形成的培养基为MS+5mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+8wt%蔗糖+0.6wt%琼脂,同时建立了一种新的多花黄精微块茎繁殖方式,在此条件下多花黄精所有内在芽均可形成微块茎,避免愈伤组织起源的不定芽形成,为块茎植物黄精开发了一种有效的微块茎形成途径,有助于更容易地储存、移植和块茎播种。同时,通过对多花黄精进行切片染色观察发现,多花黄精各部位的细胞学形态有明显差别,为判定黄精生长发育阶段提供了依据。(2)通过胁迫诱导组培发现:在黑暗培养条件有利于多花黄精块茎的增殖,这不仅为地下莲座植物组织培养提供了新的思路,也有利于大规模工厂化生产节能环保;对多花黄精组培苗进行盐胁迫的结果表明,多花黄精不是耐盐植物,无法在300m M以上NaCl浓度条件下生存。此外,还对多花黄精盐胁迫下的电导率进行了测定,并得出了电导率对应多花黄精植物体内含盐率的计算公式,为定量检测植物体内含盐率提供了依据。(3)本研究对多花黄精500m M NaCl盐胁迫处理前后的6个c DNA文库进行了转录组测序,结果显示共获得163617个新基因,基于差异分析结果发现,NaCl处理多花黄精组培苗后,共有4473个显著表达基因,其中1609个基因上调,2864个基因下调,下调基因数明显大于上调基因数,表明高盐浓度下黄精组培苗基因表达受到明显抑制。(4)通过对不同时间点和不同NaCl浓度处理下的相关基因相对表达量进行q RT-PCR分析,得出Pc-CIPK、Pc-WRKY、Pc-MYB、Pc-PLD为多花黄精盐胁迫下的正向调节因子,Pc-LOX、Pc-NPF、Pc-SPX、Pc-PER在盐胁迫下整体呈下降趋势,且Pc-Fd、Pc-PETH、Pc-LOX、Pc-NPF与NaCl浓度呈负相关,块茎膨大基因Pc-PLP在黄精块茎启生阶段高表达。(5)本研究建立的多花黄精工厂化生产技术路线主要包括以下步骤:多花黄精无菌体系的建立→诱导种子萌发→丛生芽增殖→生根→诱导内生芽形成块茎→块茎增殖→炼苗移栽→苗期管理→成熟采收→市场销售。通过成本计算及销售预测分析得出,多花黄精工厂五年的投资利润率为236.9%,工厂投资回收期为2年3个月。微块茎黑暗培养方式一年可在此基础上为工厂化育苗节约两个月的人力电力。综上可得,多花黄精微块茎黑暗培养模式有利于大幅度提升黄精工业化生产效益,黑暗和盐作为影响多花黄精块茎发育的因子,在组培条件下的模拟筛选方便快捷,为地下块茎类作物快繁移栽提供新的方法思路。同时,多花黄精在低盐浓度条件下可以正常生长发育形成微块茎的现象也为黄精中药材产业在滨海地区的种植与栽培提供了可能。
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