研究目的心血管系统疾病是全球人类健康的最大威胁之一,影响心血管系统疾病的因素非常复杂。miRNA是近年来生物医学研究的热点,生命体的许多生理过程(包括疾病的发生)都与miRNA有关。因此,深入研究miRNA与心血管系统疾病的关系将有助于人们揭示心血管系统疾病的发生机理。miRNA是长度22nt左右的非编码小RNA,通过与多种靶基因mRNA的3’UTR不完全互补结合,从而降解靶基因,达到对这些基因负向调控的目的,调节机体相应的生理功能。在]miRNA成熟的过程中,有三种关键酶的参与,其中Drosha与DGCR8结合后,在细胞核内将pri-miRNA加工成为pre-miRNA,然后pre-miRNA在细胞浆中由Dicer酶加工成为成熟的miRNA。为深入研究miRNA在血管平滑肌细胞中的功能,本课题制备了Drosha基因在血管平滑肌细胞中条件性敲除小鼠,并且利用腺病毒和逆转录病毒载体技术,构建体外培养的小鼠血管平滑肌细胞中Drosha基因敲除和抑制的模型,在体内和体外分别验证Drosha基因在血管平滑肌细胞中缺失后,动物整体发育、血管发育情况,以及对血管平滑肌细胞功能的影响,并且阐述其分子机制。本课题亦选择mir-15b/16-2为研究对象,制备了mir-15b/16-2转基因大鼠,并进行血压测定,分离出mir-15b/16-2过表达的大鼠血管平滑肌细胞,并且利用慢病毒技术,在小鼠血管平滑肌细胞中抑制mir-16的表达,进行相关表型和分子机制研究。方法第一章Drosha基因在血管平滑肌细胞中的功能和分子机制研究血管平滑肌条件性Drosha基因敲除小鼠的制备：通过Droshaloxp/loxp/SM22-Cre×Droshaloxp/+/SM22-Cre或DroshaIoxp/+/SM22-Cre×Droshaloxp/+/SM22-Cre的繁殖模式,获得Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠,提取尾组织DNA进行PCR反应检测新生小鼠基因型,检查繁殖母鼠阴道栓,当日检查有阴道栓者为胚胎期E0.5天,取E12.5、E13.5、E14.5和E15.5天的怀孕母鼠,皮下注射氯胺酮和赛拉嗪麻醉后颈椎脱臼处死,70%酒精消毒后,取胚胎卵黄囊,提取基因组DNA进行PCR反应检测基因型以确定Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎。体外培养小鼠血管平滑肌细胞中Drosha基因的敲除：分离基因型为Droshaloxp/loxp的成年小鼠血管平滑肌细胞,经过SV40质粒转染永生化之后,加入表达Cre酶和GFP的腺病毒,感染细胞24小时以上,能观察到GFP绿色荧光者为Cre酶表达阳性细胞,体外细胞水平上敲除Drosha基因。体外培养小鼠血管平滑肌细胞中Drosha基因的抑制：利用小鼠血管平滑肌细胞系和逆转录病毒介导的Drosha基因shRNA,在正常小鼠血管平滑肌细胞中沉默Drosha基因。逆转录病毒载体的包装：脂质体法将pCMV-VSVG和shRNA载体共转染至GD-293细胞系包装病毒,转染后60h收集上清,25000g,90min低温超速离心法纯化病毒。将病毒和polybrene (1ul/mlDMEM)加入在50%-60%生长密度的细胞中,培养24h后加入3ug/ml的嘌呤霉素进行筛选,具有嘌呤霉素抗性者为Drosha基因抑制阳性细胞。Drosha基因敲除小鼠胚胎脐动脉血管厚度的比较和血管平滑肌细胞增殖能力的测定：E13.5天和E14.5天的怀孕母鼠,皮下注射氯胺酮和赛拉嗪麻醉后颈椎脱臼处死,70%酒精消毒后,取正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎,去头部和尾部,取躯干部固定于10%的福尔马林,经过脱水、透明和浸蜡等步骤,包埋后制成4u1切片,HE染色;另取E13.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎脐动脉血管切片,进行脱蜡和重新水化,抗原修复结束后,PCNA-抗和荧光标记二抗孵育后,荧光倒置显微镜观察结果,拍照并进行计算阳性细胞比例。体外培养小鼠血管平滑肌细胞中Drosha基因的敲除或抑制后细胞增殖能力的测定：取生长密度70%-90%体外培养正常和Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌细胞,制备蛋白样品,进行PCNA的western blot检测。Drosha基因敲除小鼠胚胎脐动脉血管平滑肌细胞标志性基因表达水平的测定：取E13.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎脐动脉血管切片进行SMA免疫荧光染色,比较二者的荧光强度；另取E13.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎脐动脉血管,制备蛋白样品,进行SMA,SM22和CNN1的western blot检测。体外培养小鼠血管平滑肌细胞中Drosha基因的敲除或抑制后细胞标志性基因表达水平的测定：取生长密度50%-70%体外培养正常和Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌细胞,4%多聚甲醛固定,SMA一抗和荧光标记二抗孵育后,荧光倒置显微镜观察结果,拍照并进行荧光强度测定；并且制备蛋白样品,进行SMA, SM22和CNN1的western blot检测。Drosha基因敲除小鼠胚胎脐动脉血管信号蛋白p-ERK1/2和p-AKT表达水平的测定：取E13.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎脐动脉血管制备蛋白样品,进行信号蛋白p-ERKl/2和p-AKT的western blot检测。体外培养小鼠血管平滑肌细胞中Drosha基因的敲除或抑制后细胞信号蛋白p-ERK1/2和p-AKT表达水平的测定：取生长密度70%-90%体外培养正常和Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌细胞制备蛋白样品,进行信号蛋白p-ERK1/2和p-AKT的western blot检测。Drosha基因敲除小鼠胚胎脐动脉血管：niRNA表达谱的测定：利用TRIZOL法提取E13.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎脐动脉总RNA, RNeasyMinElute Cleanup Kit进一步纯化,RNA纯度和完整度通过Agilent Bioanalyzer检测。利用AffymetrixGeneChipmiRNA arrays进行miRNA微阵列表达谱测定。取lug总RNA样品,利用GenisphereFlashTag HSR kit进行polyA加尾,标记后的RNA与AffymetrixmiRNA array1.0. Chips杂交,洗脱,在FluidicStation450系统中染色,获取图像。数据分析选取正常和cKO小鼠胚胎脐动脉血管中变化2倍以上的miRNA。成熟的miRNA序列从miRBase中获得,选取成熟miRNA序列的2-7个碱基作为种子区,小鼠基因组序列中的3’UTR序列由UCSC table browser中获得,利用TargetScan6.2的PERL码预测所选miRNA的种子区与小鼠基因组3’UTR序列的互补位点。选取3’UTR序列有一个以上miRNA结合的基因进行功能相关研究,利用DAVID v6.7程序预测与靶基因相关的信号通路,通过DAVID计算Gene Ontology categories和KEGG数据库中信号通路的Fisher exact P value,GO categoteis中P值小于5.00E-07的属于enriched型的,信号通路中P值小于1.00E-04有显著性。Drosha基因敲除小鼠胚胎脐动脉血管内皮细胞标志基因CD31表达水平的测定：取E14.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎脐动脉血管进行免疫荧光染色,并制备蛋白样品,进行血管内皮细胞标志基因CD31的western blot检测。第二章Mir-15b/16-2在血管平滑肌细胞中的功能和分子机制研究Mir-15b/16-2转基因大鼠的制备：4-5周龄的雌性SD大鼠,皮下注射孕马血清(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)进行超数排卵,与雄性SD大鼠合笼,次日上午检查雌性大鼠阴道栓,收集单细胞期胚胎。将mir-15b/16-2过表达的慢病毒载体注射到单细胞期胚胎的卵周隙,在KSOM培养基中培养过夜,当发育到二细胞期的时候,移植到假孕雌性SD大鼠输卵管中,缝合后送入动物饲养室。剪取新生大鼠尾组织1-2mm,置于荧光倒置显微镜下观察,GFP表达阳性者为转基因型大鼠；GFP表达阴性着为野生型大鼠。转基因大鼠的繁殖模式为：野生型(♂)×转基因型(♀)或转基因型(♂)×野生型(♀)；进一步进行PCR反应验证,有特异性条带者为转基因型大鼠。Mir-15b/16-2转基因大鼠血压的测定：皮下包埋法持续14天给予野生型和mir-15b/16-2转基因大鼠血管紧张素Ⅱ,非侵入式血压测定仪测定第0天、第1天、第4天、第7天、第10天和第13天血压,并检测了相关指标。Mir-15b/16-2转基因大鼠血管平滑肌细胞肥大程度的测定：分离和培养成年野生型和Mir-15b/16-2转基因大鼠血管平滑肌细胞,进行细胞SMA免疫荧光染色和F-actin荧光染色,比较两种细胞的面积。Mir-15b/16-2过表达后血管平滑肌细胞中MEKl和MEK4基因表达水平的测定：取生长密度70%-90%野生型和Mir-15b/16-2转基因大鼠血管平滑肌细胞,制备蛋白样品,进行MEK1和MEK4的western blot检测。Mir-15b/16-2过表达后血管平滑肌细胞中信号蛋白p-ERK1/2和p-P38表达水平的测定：取生长密度70%-90%野生型和Mir-15b/16-2转基因大鼠血管平滑肌细胞,制备蛋白样品,进行p-ERK1/2和p-P38的western blot检测。体外培养小鼠血管平滑肌细胞中mir-16的抑制：构建anti-mir-16慢病毒载体,结合辅助质粒共转染293T细胞,37℃,5%C02条件下培养48-72h,收集上清,25000rpm,4℃超速低温离心2h浓缩病毒,重悬于DMEM培养基中,分装后保存于-80℃超低温冰箱,将病毒和polybrene (1ul/m1DMEM)加入在50%-60%生长密度的细胞中,培养24h后加入3ug/ml的嘌呤霉素进行筛选,具有嘌呤霉素抗性者为mir-16表达抑制的阳性细胞。mir-16抑制后小鼠血管平滑肌细胞增殖能力的测定：取生长密度70%左右体外培养mir-16抑制后的小鼠血管平滑肌细胞,进行BrdU的免疫荧光染色,并且制备蛋白样品,进行PCNA的western blot检测。mir-16抑制后小鼠血管平滑肌细胞迁移能力的测定：细胞培养用六孔板中加入对照组和mir-16抑制后的小鼠血管平滑肌细胞,37℃,5%C02条件下培养48h,待细胞单层生长铺满孔面,用200ul无菌枪头划过细胞,用PBS轻轻吹洗去脱落的细胞碎片,测定划痕距离。继续放入37℃,5%C02细胞培养箱中,24h后分别测定划痕距离。mir-16抑制后小鼠血管平滑肌细胞中信号蛋白和p-P38表达水平的测定：取p-ERK1/2生长密度50%-70%体外培养对照组和mir-16抑制后的小鼠血管平滑肌细胞,经血管紧张素Ⅱ诱导后,制备蛋白样品,进行和p-P38的p-ERK1/2检测。mir-16抑制后对小鼠血管平滑肌细胞细胞标志性基因表达水平的测定：取western blot生长密度70%-90%体外培养对照组和mir-16抑制后的小鼠血管平滑肌细胞,制备蛋白样品,进行和CNN1的SMA,SM22检测,并且对对照组和western blotmir-16抑制后的小鼠血管平滑肌细胞进一步进行CNN1免疫荧光染色。结果第一章基因在血管平滑肌细胞中的功能和分子机制研究Drosha血管平滑肌细胞中Drosha基因敲除后,胚胎脐动脉血管中Drosha基因表达水平降低,小鼠胚胎死亡时间为E13.5天和E14.5天之间。E13.5天cKO胚胎卵黄囊血管分布比正常胚胎少,E14.5天后则完全消失；E13.5天cKO胚胎表型与正常胚胎差别不大,E14.5天cKO胚胎肝脏严重出血,胚胎死亡。Drosha基因敲除胚胎胸主动脉血管厚度均比正常胚胎小。E13.5天Drosha基因敲除胚胎比正常胚胎胸主动脉血管PCNA阳性细胞比例显著降低,western blot结果显示,Drosha基因敲除胚胎比正常胚胎胸主动脉血管PCNA表达水平降低。E13.5天Drosha基因敲除胚胎比正常胚胎胸主动脉血管SMA免疫荧光强度显著降低,western blot结果显示,Drosha基因敲除胚胎比正常胚胎胸主动脉血管SMA. SM22和CNN1表达水平均降低。E13.5天Drosha基因敲除胚胎与正常胚胎胸主动脉血管western blot结果显示,Drosha基因敲除胚胎比正常胚胎胸主动脉血管信号蛋白p-ERKl/2和p-AKT表达水平均降低。Western blot结果显示,体外培养Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌细胞比正常小鼠血管平滑肌细胞PCNA表达水平降低。体外培养Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌细胞比正常小鼠血管平滑肌细胞SMA免疫荧光强度显著降低,western blot检测结果显示,Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌细胞SMA、SM22和CNN1表达水平降低。体外培养Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌细胞western blot检测结果显示,Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌细胞信号蛋白p-ERK1/2和p-AKT表达水平均降低。利用miRNA array的方法检测正常和Drosha基因敲除胚胎血管平滑肌细胞中miRNA的表达谱,在670个小鼠miRNA探针中过滤掉低信号,获得198个miRNA的array数据,其中104个在cKO胚胎的脐动脉血管中表达明显降低,27个没有明显变化,67个表达上升。选取46种变化2倍以上(升高或降低)的miRNA,利用DAVID分析其3890种靶基因,获得19个显著的Enriched型的功能类型,其中最显著的两个功能类型是phosphoprotein(P-value=1.1×10-82)和alternative splicing (P-value=1.9×10-41)。通过分析KEGG信号通路,获得变化较大的几条信号通路,包括MAPK, WNT, actin-cytoskeleton调节通路等。第二章Mir-15b/16-2在血管平滑肌细胞中的功能和分子机制研究成功获得mir-15b/16-2转基因大鼠,其由血管紧张素Ⅱ诱导的血压(收缩压、舒张压)低于野生型,测得其它相关指标亦符合该趋势。mir-15b/16-2转基因大鼠血管平滑肌细胞可表达GFP绿色荧光,F-actin染色显示其细胞面积小于野生型。与野生型相比,Mir-15b/16-2转基因大鼠血管平滑肌细胞MEK1和MEK4免疫荧光强度显著降低,western blot检测MEK1和MEK4表达水平降低。western blot检测结果显示,与野生型相比,Mir-15b/16-2转基因大鼠血管平滑肌细胞中信号蛋白p-ERK1/2和p-P38表达水平均降低。mir-16基因抑制后的小鼠血管平滑肌细胞中MEK1和MEK4基因表达水平升高。BrdU荧光染色结果显示mir-16基因抑制后小鼠血管平滑肌细胞BrdU阳性细胞数比例显著高于正常小鼠血管平滑肌细胞。mir-16基因抑制后,经血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠血管平滑肌细胞中信号蛋白p-ERK1/2和p-P38表达水平均升高。mir-16基因抑制后小鼠血管平滑肌细胞的划痕修复能力与正常组相比显著增强,与正常组相比,mir-16基因抑制后小鼠血管平滑肌细胞中CNN1表达水平升高,而SMA和SM22表达水平无明显变化。免疫荧光染色结果显示,mir-16基因抑制后小鼠血管平滑肌细胞CNN1荧光强度显著升高。结论第一章Drosha基因在血管平滑肌细胞中的功能和分子机制研究成功制备Drosha基因在血管平滑肌细胞中条件性敲除小鼠。小鼠血管平滑肌细胞中敲除Drosha基因后,导致小鼠早期胚胎死亡,肝脏严重出血,血管发育迟缓,血管平滑肌细胞增殖能力降低,标志基因SMA、SM22和CNN1表达降低,信号蛋白p-ERK1/2和p-AKT表达降低,血管内皮细胞标志基因CD31表达降低,说明Drosha基因在血管平滑肌细胞中行使重要的功能,并且影响到血管内皮细胞的功能。血管平滑肌细胞中Drosha基因的缺失导致miRNA表达谱的变化,一些与血管平滑肌功能相关的miRNA表达水平降低,引起了多个与血管平滑肌细胞生长和功能相关的信号通路改变。第二章Mir-15b/16-2在血管平滑肌细胞中的功能和分子机制研究成功制备mir-15b/16-2转基因大鼠,mir-15b/16-2可降低由血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠血压(收缩压和收缩压)。M ir-15b/16-2在大鼠血管平滑肌细胞中过表达之后,细胞肥大程度降低,MEK1和MEK4及其下游信号蛋白p-ERKl/2和p-P38表达水平降低；mir-16在小鼠平滑肌细胞中表达抑制之后,细胞增殖和迁移能力升高,MEK1和MEK4及其下游信号蛋白p-ERK1/2和p-P38表达水平升高,标志基因CNN1表达水平升高。