研究背景近几十年来,由于子宫内膜癌呈现世界性的高发病率,其死亡人数高于同期卵巢癌及宫颈癌患者,使得研究界及医疗界对子宫内膜癌的关注日趋上升,因此如何改善对子宫内膜癌患者的治疗疗效尤显重要。对于多数子宫内膜癌患者的治疗,手术仍是其主要的治疗方式。但对于低分化或无分化型的I型子宫内膜样腺癌,以及Ⅱ型非腺癌类的子宫内膜癌患者,治疗后的原位复发率较高,5年生存率低于50%,称之为高危型子宫内膜癌。对于此类患者,在手术治疗的同时,辅助放疗(RT)是其最主要的治疗方式。但临床资料显示,放疗并不能改善高危型子宫内膜癌患者的长期生存率。放疗在杀伤普通肿瘤细胞的同时,不能有效的杀伤对放疗具有耐受性的肿瘤干细胞(CSC),使得学界对放疗提出了诸多质疑。肿瘤干细胞具有自我更新及分化的潜能,因此具有高度的成瘤性,在一定条件下,还可与非肿瘤干细胞之间形成双向性转化,其调控机制可能与一群细胞转录因子关系密切,称为干细胞转录因子(STFs)。在子宫内膜癌中,体内、体外实验均证实有肿瘤干细胞的存在,其中干细胞转录因子SOX9、Nanog、HER2、OCT4和Slug等可能参与了对子宫内膜癌中肿瘤干细胞的调控及肿瘤的复发过程。因此我们在杀伤肿瘤细胞的同时,如何下调肿瘤干细胞转录因子的表达,从而靶向性杀伤肿瘤干细胞,将成为有望攻克肿瘤的新方向。乙醛脱氢酶(ALDH)是参与氧化代谢的酶,其中ALDH1在子宫内膜癌中具有干细胞特性的肿瘤细胞中表达异常增高,ALDH+已作为标志物用于对肿瘤干细胞的检测,有望成为治疗肿瘤干细胞的新靶点。Disulfiram(DSF)是ALDH不可逆的抑制剂,作为戒酒药已被FDA批准而广泛使用多年,具有价格低廉、副反应轻,可长期给药的优势。临床上DSF用于戒酒可每日口服片剂250–500mg,并能长期服用,尚未观察到明显的副反应发生,平均药物代谢血浆浓度为7.2–27μM。近年发现DSF能与铜离子(Cu2+)结合,形成DSF和Cu2+复合物(DSF/Cu),通过多种途径抑制肿瘤细胞的生长,促进凋亡。Cu2+在正常组织中表达极少,而在CD133表达阳性(CD133+)的肿瘤干细胞区域富集最明显。Cu2+这一区域分布的差异性,使得DSF/Cu能靶向性杀伤肿瘤干细胞成为可能。但目前对DSF/Cu的抗肿瘤作用机制尚不清楚。本课题组前期研究显示,DSF/Cu能通过抑制乳腺癌细胞中NF-kB的活性,下调HER2、MYC等干细胞转录因子的表达,从而逆转乳腺癌非肿瘤干细胞向肿瘤干细胞的转化。在子宫内膜癌中,SOX9、OCT4和HER2等因子与肿瘤干细胞功能的维持关系密切,并具有NF-kB的结合位点。因此DSF/Cu是否能通过对NF-kB通路的下调,抑制干细胞转录因子的表达,实现对子宫内膜癌中肿瘤干细胞的治疗作用有待研究。本课题选用人类低危型子宫内膜癌Ishikawa细胞系及人类高危型子宫内膜癌AN 3CA细胞系作为研究对象,首先检测放疗对其肿瘤干细胞数量及功能的影响,接着检测放疗联合DSF药物对以上两种人类子宫内膜癌细胞系及人类子宫内膜癌动物模型的治疗疗效,并对放疗联合DSF药物的作用机制进行检测。目前就放疗以及联合治疗对子宫内膜癌中肿瘤干细胞的疗效研究,尚未见相关报道。第一部分放疗对子宫内膜癌中肿瘤干细胞的影响目的本部分旨在探究放疗对人类子宫内膜癌细胞系中,肿瘤干细胞数量及成瘤功能的影响,为放疗在临床中的应用提供理论指导。方法1采用流式细胞术,对放疗前后人类高危型子宫内膜癌患者来源的AN 3CA和低危型子宫内膜癌患者来源的Ishikawa细胞系中ALDH+、CD133+的细胞数量进行检测。2采用体外微球形成实验,对放疗前后AN 3CA和Ishikawa细胞系的体外微球形成数进行检测,并计算放疗组的微球形成抑制率。采用体内成瘤性实验,将放疗前和放疗后AN 3CA和Ishikawa细胞系分别种植于nude品系裸鼠体内,就肿瘤的成瘤率及肿瘤体积进行检测。3采用克隆形成实验,对未放疗组和放疗组中AN 3CA和Ishikawa细胞系的克隆形成抑制率进行检测。4统计学方法采用SPSS19.0统计分析软件进行数据处理,两组均数比较时,若方差齐时采用两独立样本t检验,方差不齐时采用Cochran近似t检验,以α=0.05作为检验水准。结果1比较放疗前后AN 3CA和Ishikawa细胞系中肿瘤干细胞数量的变化在AN 3CA细胞系中,放疗组ALDH+、CD133+细胞的平均百分比与未放疗组相比可见明显增高,放疗组为(2.0±0.14)%、(1.9±0.00)%,未放疗组为(0.95±0.07)%、(1.45±0.21)%,差异有统计学意义(P<0.05)。但在Ishikawa细胞系中,放疗组ALDH+、CD133+细胞的平均百分比与未放疗组相比未见明显增高(P>0.05)。2比较放疗前后AN 3CA和Ishikawa细胞系成瘤性的变化在AN 3CA细胞系中,放疗组肿瘤干细胞体外成瘤性与未放疗组相比未见明显降低(P>0.05)。相对于未放疗组,放疗组的微球形成抑制率为11.81%。而在Ishikawa细胞系中,与未放疗组相比,放疗组能显著性降低肿瘤干细胞的体外成瘤性,放疗组微球形成数为(32.25±3.59)个,未放疗组为(56.50±3.13)个,差异有显著统计学意义(P<0.01)。相对于未放疗组,放疗组的微球形成抑制率为43.18%。放疗后AN 3CA细胞在裸鼠体内的成瘤率为83.3%(5/6),与未放疗组相同;放疗组肿瘤平均体积高于未放疗组,放疗组为(667.70±90.92)mm3,未放疗组为(549.97±40.28)mm3,但差异无统计学意义。3放疗组对子宫内膜癌中肿瘤干细胞的杀伤特异性:在Ishikawa细胞系中,放疗组对微球形成的抑制率(反应对肿瘤干细胞的杀伤性)与对克隆形成的抑制率(反应对肿瘤细胞的杀伤性)相似,为43.18%和36.33%,差异无统计学意义(P>0.05)。但AN 3CA细胞系中,放疗组对微球形成的抑制率明显低于对克隆形成的抑制率(P<0.05)。结论放疗能非特异性的杀伤人类Ⅰ型子宫内膜癌Ishikawa细胞系中的肿瘤干细胞,但不能有效的杀伤人类Ⅱ型子宫内膜癌AN 3CA细胞系中的肿瘤干细胞。第二部分放疗联合DSF对子宫内膜癌及其肿瘤干细胞的影响目的本部分研究应用放疗联合DSF药物,探讨联合治疗对人类子宫内膜癌细胞系和人类子宫内膜癌动物模型中肿瘤细胞及其中的肿瘤干细胞的杀伤性,为临床用药的有效性及安全性提供理论依据。方法1采用MTT法检测,对未治疗组、DMSO组(DMSO为溶剂对照)、DSF组和DSF/Cu组中,AN 3CA和Ishikawa细胞的生长抑制率进行检测。2采用流式细胞术,对未放疗组、放疗+DMSO组、放疗+DSF组和放疗+DSF/Cu组中,AN 3CA和Ishikawa细胞系的ALDH+、CD133+细胞数量进行检测。3采用体外微球形成实验,对放疗+DMSO组和放疗+DSF/Cu联合治疗组中AN3CA和Ishikawa细胞系体外微球形成数进行检测,并计算微球形成抑制率。采用体内成瘤性实验,将放疗+DMSO和放疗+DSF/Cu治疗后的AN 3CA细胞系分别种植于nude品系裸鼠右后大腿外侧,就肿瘤的成瘤率及肿瘤体积进行检测。4采用克隆形成试验,对未放疗组、放疗+DMSO组和放疗+DSF/Cu组中AN3CA和Ishikawa细胞系的克隆形成抑制率进行检测。5采用蛋白印迹实验(WB),对放疗+DMSO组和放疗+DSF/Cu联合治疗组中AN 3CA和Ishikawa细胞系的促凋亡蛋白Cleaved-PARP和PARP的表达水平进行检测。6选用AN3CA细胞系,建立人类子宫内膜癌动物模型,对未治疗组、放疗组、放疗+DSF组和放疗+DSF/Cu组治疗后的肿瘤体积、肿瘤重量、裸鼠体重、肿瘤复发、裸鼠生存率以及肿瘤组织的体外微球形成数的变化进行检测。7统计学方法采用SPSS19.0统计分析软件进行数据处理,两组均数比较时,若方差齐时采用两独立样本t检验,方差不齐时采用Cochran近似t检验,细胞的微球形成抑制率与克隆形成率的比较采用χ2检验的Fisher精确概率法,以α=0.05作为检验水准。结果1比较DSF和DSF/Cu对AN 3CA和Ishikawa细胞的生长抑制率在AN 3CA和Ishikawa细胞系中,与DSF组相比,DSF/Cu组能明显降低细胞的生长抑制率,有统计学意义(P<0.05)。2比较放疗联合DSF/Cu或DSF组和放疗组对AN 3CA和Ishikawa细胞系中肿瘤干细胞数量及成瘤性的影响:在AN 3CA和Ishikawa细胞系中,放疗+DSF/Cu组ALDH+、CD133+细胞的平均百分数与放疗+DMSO组相比可见明显降低,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。但放疗+DSF组ALDH+、CD133+细胞的平均百分数与放疗+DMSO组相比未见明显降低。放疗+DSF/Cu组Ishikawa、AN 3CA细胞系体外成瘤性与放疗+DMSO组相比,可见明显降低,差异有显著统计学意义(P<0.01)。AN 3CA细胞系经放疗+DSF/Cu联合治疗后,在裸鼠体内的成瘤率为50%(n=3/6,)明显低于放疗+DMSO组83%(n=5/6);放疗+DSF/Cu联合治疗的肿瘤平均体积亦小于放疗+DMSO组,联合治疗组为(152.49±40.96)mm3,放疗组为(557.78±64.12)mm3,差异有显著统计学意义(P<0.01)。3放疗联合DSF/Cu组对子宫内膜癌干细胞的杀伤特异性:在AN 3CA细胞中,放疗+DSF/Cu联合治疗组对细胞微球形成的抑制率(反应对肿瘤干细胞的杀伤性)明显高于对克隆形成的抑制率(反应对肿瘤细胞的杀伤性),分别为88.89%和66.15%,差异有显著统计学意义(P<0.01)。在Ishikawa细胞中,放疗+DSF/Cu联合治疗组对细胞微球形成的抑制率明显高于对克隆形成的抑制率,分别为98.18%和68.89%,差异有显著统计学意义(P<0.01)。4比较放疗联合DSF/Cu组及放疗组对AN 3CA和Ishikawa细胞系凋亡的影响:放疗+DSF/Cu联合治疗组AN 3CA、Ishikawa细胞系中Cleaved-PARP的蛋白表达水平与放疗组相比可见明显升高,联合治疗组凝胶灰度比值为1.64±0.09、0.91±1.01,放疗组为0.91±1.01、0.29±0.20,差异有统计学意义(P<0.05)。5各治疗组对人类子宫内膜癌动物模型的肿瘤大小、裸鼠体重、肿瘤复发率、裸鼠生存率及体外成瘤性影响的比较:放联合DSF/Cu组的肿瘤平均体积、重量与放疗组相比,未见明显减小(P>0.05);但肿瘤组织平均体外微球形成数,放疗联合DSF/Cu组与放疗组相比,可见明显降低,放疗联合DSF/Cu组为(19.33±3.79)个,放疗组为(44.00±12.49)个,差异有统计学意义(P<0.05)。放疗联合DSF组移植瘤平均体积、重量与放疗组相比,可见明显减小,裸鼠体重与放疗组相比可见明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05);放疗联合DSF组肿瘤复发率最低,裸鼠生存率最高;肿瘤组织平均体外微球形成数,放疗联合DSF组与放疗组相比可见明显降低,为(3.33±1.53)个和(44.00±12.49)个,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论1.体外实验证实,放疗联合DSF/Cu能靶向性杀伤人类子宫内膜癌AN 3CA和Ishikawa细胞系中的肿瘤干细胞,同时促进癌细胞的凋亡。2.体内实验证实,放疗联合DSF可认为是一种治疗子宫内膜癌安全、有效的治疗方式。性的机制研究第三部分放疗联合DSF对子宫内膜癌中肿瘤干细胞杀伤目的首先探究放疗是否能上调AN 3CA和Ishikawa细胞系中干细胞转录因子SOX9、Nanog、HER2、OCT4和Slug的表达水平,进一步检测放疗联合DSF/Cu是否能通过下调NF-kB通路,从而降低由于放疗后升高的干细胞转录因子的表达。方法1采用实时荧光定量PCR法,检测放疗前后,AN 3CA和Ishikawa细胞系中,SOX9、Nanog、HER2、OCT4和Slug因子m RNA水平的表达,筛选出经放疗后增高的干细胞转录因子。3进一步通过实时荧光定量PCR法和蛋白印迹实验,比较未放疗组、放疗+DMSO组、放疗+DSF/Cu组对放疗后增高的干细胞转录因子表达水平的影响。4将携带NF-kB启动子的质粒p GL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro]和内参照质粒p RL-SV40同时转染子宫内膜癌AN 3CA和Ishikawa细胞系,构建瞬时转染细胞模型,采用双荧光素酶报告基因实验,检测未放疗组、放疗+DMSO组和放疗+DSF/Cu组中NF-kB的活性荧光强度比值,采用放疗+NF-kB抑制剂(IMD-0354)组为阳性对照。5应用放疗联合NF-kB抑制剂,下调AN 3CA和Ishikawa细胞系中NF-kB通路的活性,通过实时荧光定量PCR法和蛋白印迹实验,比较放疗+DSF/Cu组和放疗+NF-kB抑制剂组中干细胞转录因子的表达水平。6统计学方法采用SPSS19.0统计分析软件进行数据处理,两组均数比较时,若方差齐时采用两独立样本t检验,方差不齐时采用Cochran近似t检验,以α=0.05作为检验水准。结果1放疗前后AN 3CA和Ishikawa细胞系中干细胞转录因子SOX9、Nanog、HER2、OCT4和Slug的表达水平:放疗后AN 3CA细胞中SOX9、OCT4和Slug因子的m RNA及蛋白表达水平与未放疗组相比可见明显升高,放疗组平均凝胶灰度比值分别为1.26±0.06、12.64±0.15、1.33±0.05,未放疗组为0.36±0.16、1.12±0.12、0.53±0.11,差异均有统计学意义(P<0.05);但Ishikawa细胞中未检测到放疗后升高的干细胞转录因子的表达。2对比放疗+DSF/Cu联合治疗(联合治疗)和放疗+DMSO治疗(放疗)后对子宫内膜癌细胞系中NF-kB/干细胞转录因子通路的影响2.1联合治疗以及放疗组对AN 3CA和Ishikawa细胞系中NF-kB活性影响的比较:联合治疗组中AN 3CA和Ishikawa细胞系的NF-kB活性与放疗组相比可见明显降低,联合治疗组荧光强度比值分别为0.36±0.04和0.40±0.01,放疗组为1.23±0.03和1.05±0.02,差异有显著统计学意义(P<0.01)。2.2联合治疗以及放疗组对AN 3CA和Ishikawa细胞系中SOX9、OCT4、Slug因子m RNA和蛋白水平的影响:在AN 3CA和Ishikawa细胞中,联合治疗后SOX9、OCT4和Slug因子的m RNA和蛋白表达水平与放疗组相比均可见明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2.3 NF-kB的下调对AN 3CA和Ishikawa细胞系中SOX9、OCT4、Slug因子m RNA及蛋白水平的影响:在AN 3CA和Ishikawa细胞中,放疗联合NF-kBi组能显著性降低SOX9、OCT4因子的m RNA和蛋白表达水平,与放疗组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);但放疗联合NF-kBi组不能降低Slug因子的m RNA和蛋白表达水平,与放疗组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.放疗能上调AN 3CA细胞系中干细胞转录因子SOX9、OCT4和Slug的表达。2.放疗联合DSF/Cu能下调子宫内膜癌AN 3CA和Ishikawa细胞系中NF-kB/SOX9、OCT4通路及非NF-kB/Slug通路的活性。