肌萎性脊髓侧索硬化症(ALS)是一种常见的成人神经退行性疾病,导致运动神经元的选择性退化。铜锌超氧化物歧化酶(Cu2Zn2SOD)的突变引起结构和金属结合性质的变化,及由此导致的氧化毒性和蛋白质聚集作用可能是导致 ALS 的重要原因之一。我们用缺锌多铜的超氧化物歧化酶(CunSOD)作为 Cu2Zn2SOD 突变体的模型,在生理条件下,研究 CunSOD (n=0, 1, 2, 3, 4)对质粒 DNA 及自身的氧化损伤,希望从中建立因结构和金属结合性质变化导致的 Cu2Zn2SOD 突变体的氧化性和聚集作用之间的关系,从化学的角度探讨一些与病变蛋白质有关的神经推行性疾病,如早老性痴呆症(Alzheimer’s disease),疯牛病(prion disease)及 ALS 等的可能致病机理。 研究结果显示在过氧化氢,巯基乙醇或两者都存在条件下,CunSOD 导致质粒DNA 的氧化断裂。与天然 Cu2Zn2SOD,脱金属辅基 SOD(ApoSOD)或单独铜离子比较,CunSOD 表现出更强的氧化活性。CunSOD 氧化断裂 DNA 不受甘露醇,聚乙二醇和二甲基亚砜等自由基猝灭剂的影响,高浓度的乙二胺四乙酸能有效抑制该反应。这说明 CunSOD 氧化断裂 DNA 需要铜离子的参与,但不是简单的自由铜离子的作用。CunSOD 氧化断裂 DNA 受 pH 的影响,pH6.8-7.4,氧化作用最强。 我们研究了 CunSOD 氧化断裂 DNA 的反应动力学。结果表明 CunSOD(n=1-4)氧化断裂 DNA 的反应是一快一慢的两步连串反应(k1/k2≈10),反应速率常数 k1 随着CunSOD 中铜离子个数的增加而增大,反映了金属离子对 CunSOD 氧化断裂 DNA 活性的影响。但是,过多的铜离子并不明显的促进反应,当铜离子与 CunSOD 的摩尔浓度比大于 8,CunSOD 氧化断裂 DNA 不受铜离子浓度的影响。用反应参数 K 和 Vmax描述了 CunSOD 氧化断裂 DNA 随 CunSOD 浓度变化的特性,K 定义为 CunSOD 氧化断裂 DNA 的反应速率达到最大反应速率一半的时候所需最少的 CunSOD 的浓度;Vmax定义为 CunSOD 氧化断裂 DNA 的最大速率。K 和 Vmax不因 CunSOD 中铜离子个数的不同而变化,反映了 CunSOD 与 DNA 相互作用的特性。 我们在实验过程中发现 CO2对 CunSOD 氧化断裂 DNA 有明显的促进作用,现象 I<WP=4>与文献报道 CO2能够促进 Cu2Zn2SOD 氧化其它底物相同,但是我们同时发现 N2也能促进 CunSOD 氧化断裂 DNA,并用 Ar 作对照,发现 Ar 不能促进该反应,这排除了气体分子本身物理作用对 DNA 的影响。N2可能与 CunSOD 的铜离子活性中心结合,使反应生成的?OH 更容易离去,作用于底物。N2的促进作用也表明 CO2促进 CunSOD氧化断裂 DNA 可能有与文献报道不同的机理。CunSOD 的 SDS-PAGE 发现 CunSOD 形成二聚体,该二聚体不受 SDS 的影响,但在巯基乙醇或过氧化氢作用下解聚。表明 CunSOD 二聚体可能是借助铜离子桥连配位形成的蛋白质交联。用生物信息学方法分析可能的桥连部位是组氨酸 110。CunSOD在过氧化氢存在下表现出强的自氧化作用,导致二聚体的分解和肽链的断裂。CunSOD还能导致天然 Cu2Zn2SOD,ApoSOD 和含锌缺铜 SOD 聚集。最后结合 CunSOD 与小牛胸腺 DNA 相互作用的光谱和简单的生物信息学方法,预测了 CunSOD 与 DNA 的可能的结合部位。提出了 CunSOD 导致自身及 DNA 的氧化损伤的可能机理。