两栖类是一类可持续利用的自然资源,具有重要的经济、科研、生态以及文化价值。地球上拥有丰富的两栖类资源,它是世界生物资源的重要组成部分,也是人类的宝贵财富。两栖类动物为了生存,其皮肤进化为具有药理学活性的器官并显示出多样性的防御功能是合理的,也是必要的。两栖类皮肤腺体含有丰富的分泌物,其中含有大量的分子结构特殊,功能多样的生物活性物质,是一个天然的药物宝库。近年来,已从两栖类动物皮肤中鉴定出许多多肽类家族,包括铃蟾肽、蛋白酶抑制剂、抗菌肽、速激肽、胆囊收缩素、缓激肽、抗氧化肽以及基因编码的神经毒素等。但从两栖类皮肤中发现的具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性的多肽依然很少。我们以南美常见的角蛙为研究对象,构建了南美角蛙皮肤的cDNA文库,通过本实验室已经从南美角蛙皮肤中筛选出的序列cystatin-cp(该序列通过NCBI蛋白质数据库进行BLAST比对,其蛋白质一级结构与来源于双齿围沙蚕的cystatin B有41%的同源性)设计了级联PCR引物,成功地克隆到该序列并构建了其原核表达系统。我们利用大肠杆菌pET-32a表达系统成功对cystatin-cp融合蛋白进行了诱导表达,经过菌体超声破碎,Ni2+亲和层析,甲酸切割方法将cystatin-cp与组氨酸标签分开,然后利用分子筛Sephadex G-50凝胶层析和反相高效液相层析(RP-HPLC)纯化方法,得到了具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性的表达蛋白。利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪测定表达蛋白产物的分子量为10035.0 Da,与理论预测并不符合。通过对成熟肽氨基酸序列分析,我们认为在甲酸切割时,融合蛋白并未在DP位点进行切割,而是在成熟肽的8Gly和9Pro之间进行了错误切割,并且成熟肽进行质谱检测时,在离子化过程中其某一区域结合了一个金属离子。以发色底物P3169(Sigma)进行酶动力学反应,测定得到该蛋白酶的抑制常数Ki值为27.594μM。