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乙型肝炎病毒感染(hepatitis B Virus, HBV)是一个威胁人类健康的全球性公共卫生问题。据估计目前全球约有20亿人曾感染过HBV,其中3.5亿以上为慢性HBV感染者。世界范围内,每年约有68.6万人死于HBV感染所致的终末期肝脏疾病,如肝功能衰竭(hepatic failure, HF)、肝硬化(liver cirrhosis, LC)和肝细胞癌(hepatocelluar carcinoma, HCC)。中国属乙型肝炎病毒感染高发区,目前我国有慢性HBV感染者约9300万人,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者约2000万人。HBV基因组由正链和负链组成双链环状DNA。其负链包含有4个开放性阅读框(open reading frame, ORF),分别为S区、C区、P区和X区。S区中的S基因编码主蛋白HBsAg,即S蛋白。S蛋白全长226个氨基酸残基,包括N端(aa 1-99),主要亲水区(aa 100-169)和C端(aa 170-226),其中“a”决定簇(aa 124-147)位于主要亲水区内。“a”决定簇高度保守,为所有亚型所共有。其作用在于维持HBsAg的稳定性、空间构象以及免疫原性。此外,免疫应答细胞和抗体通过定位这个区域以识别HBsAg,从而对所有HBV亚型产生抵抗力。血清HBsAg阳性代表现症HBV感染；HBsAb为保护性中和抗体,阳性代表机体对HBV有免疫力。传统观念认为,HBsAb为保护性中和抗体,同一患者血清不可能同时检测出HBsAg和HBsAb。随着近些年国内外关于HBsAg和HBsAb共存的报道越来越多,这对矛盾体的出现彻底挑战了上述传统观点。研究表明,HBsAg+/HBsAb+患者发展为晚期肝病的机率较HBsAg+/HBsAb-高。HBsAg和HBsAb共存原因尚不明确,本研究旨在揭示HBsAg和HBsAb双阳性与S蛋白氨基酸突变的关系。第一部分慢性HBV感染HBsAg与HBsAb双阳患者临床特征本研究旨在探索HBsAg和HBsAb共存患者的临床特征。本课题组收集慢性HBV感染且HBsAg和HBsAb共存患者15例作为实验组,选取同期22例HBsAg+/HBsAb-慢性HBV感染者作为对照组。抽取两组患者外周血并分离血清,采用酶联免疫法和化学发光微粒子免疫分析技术定性及定量检测两组成员乙型肝炎血清学标志物；采用速率法检测血清丙氨酸氨基转移酶；采用PCR-荧光探针法定量试剂盒检测血清HBV DNA水平。采用SPSS17.0统计软件比较分析两组患者临床特征,结果显示两组在患者年龄、性别、HBsAg滴度、血清丙氨酸氨基转移酶、HBeAg阳性率、基因型及血清HBV DNA水平之间的差异均无统计学意义。第二部分HBsAg与HBsAb双阳患者S蛋白氨基酸突变分析本部分旨在利用PCR技术和分子克隆-DNA测序技术,对HBsAg+/HBsAb+和HBsAg+/HBsAb-患者S蛋白氨基酸序列比对分析,从而揭示HBsAg和HBsAb共存与S蛋白氨基酸突变之间的联系。本课题组使用试剂盒提取两组患者血清HBV DNA;设计、合成扩增HBV S基因的引物并扩增两组患者血清HBV S基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,经纯化、回收及克隆后行测序分析。运用Chromas软件和Omiga软件分析测序结果,并将所得氨基酸序列与NCBI数据库中的参考序列对比。最后运用SPSS 17.0统计软件分析比较两组S蛋白氨基酸突变率之间的差异。结果显示两组氨基酸残基突变最频繁的位点是s126,只有实验组成员存在T/I126A/S、P127T、G130E/N、M133S、F134I、T140I和G145R氨基酸突变;这些位点都被证实与HBsAg的免疫原性改变有关。主要亲水区(p=0.000)和N端(p=0.029)的氨基酸突变率实验组显著高于对照组,而在C端(p=0.878)两组无显著性差异。特别重要的是,“a”决定簇内,实验组的氨基酸突变率显著高于对照组(p=0.008)；且对比“a”决定簇内的两个环形结构区域的氨基酸突变率,两组在第一环的氨基酸突变率有显著性差异(p=0.006),而在第二环(p=0.687)两组的突变率并无显著差异。本研究揭示了HBsAg和HBsAb共存与S蛋白“a”决定簇及其周围区域的氨基酸高频率突变有关,为后续探讨这些区域的氨基酸突变导致HBsAg的免疫原性改变提供了重要的理论依据,有利于临床指导随访、判断预后,为防止或延缓疾病进展为晚期肝病提供方案。综上所述,慢性HBV感染HBsAg和HBsAb共存患者与HBsAg+/HBsAb-患者的临床特征无统计学差异。HBsAg和HBsAb共存与S蛋白“a”决定簇及其周围区域的氨基酸高频率突变有关。