论文部分内容阅读
猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)引起的一种自然疫源性人畜共患传染病,主要表现为脑炎、心肌炎或心肌周围炎以及母猪的繁殖障碍等症状。该病在世界各国均有流行,造成的经济损失较为严重,血清学调查发现,我国规模化的猪场普遍感染EMCV。由于EMCV是目前危害我国养猪业健康发展的重要疫病之一。因此,开展对脑心肌炎的诊断与防制研究,不仅对防治猪脑心肌炎具有必要性,而且具有重要的公共卫生意义。本研究针对EMCV3D基因设计并合成了LAMP反应所需引物,初步建立了一套总体系为25.0μL的EMCV LAMP扩增反应体系；根据该反应体系扩增产物可见,阴阳性区分明显,阳性肉眼可见明显白色沉淀,加入荧光染料后出现变色反应,电泳结果可见明显梯形条带。将上述建立的LAMP扩增反应体系进行Tm值、反应时间、温度等条件优化,最终确定内外引物浓度比为5：1(内外引物使用浓度分别为50μM,10μM),反应温度为64℃,反应时间为60min时本体系可达最佳；对该法进行特异性、灵敏性等试验,证明该方法对EMCV检测特异性好,与常规PCR相比灵敏性高1个数量级；通过对随机选取的100份猪血清样本进行LAMP与ELISA检测,结果显示,LAMP与ELISA检测结果的符合率为97.0%。针对EMCV3D基因保守区段设计、合成Real-time PCR引物及探针,成功建立了一套总体系为25.0μL的EMCV Real-time PCR反应体系,并利用该体系对设计合成的几套引物及探针组合进行优选,最终筛选出最适合本体系的组合为引物EMCV-LZD-F1/R1及Probe1。对所建立的EMCV Real-time PCR检测方法进行Tm值、引物使用浓度等条件优化,最终确定EMCV Real-time PCR反应体系在Tm值60℃,上下游引物使用浓度为10pmcl/μL,探针使用浓度为5pmol/μL时反应体系可达最佳；进行特异性、灵敏性等试验,发现特异性好,灵敏性较常规PCR检测高出100倍；通过对随机选取的98份猪血清样本分别进行Real-time PCR法与ELISA法检测,由检测结果可知,Real-time PCR与ELISA检测结果的符合率可达98.0%。综上,本研究成功建立了EMCV LAMP及Real-time PCR检测方法,两种方法特异性、灵敏性均较好,田间样本检测结果显示,与同期进行的ELISA检测结果符合率较高,可用于田间样本检测及分析。LAMP方法更适用于基层检测,这是由于该法简便、快速,且没有很高的硬件要求,Real-time PCR更适用于科研试验。总之两种检测方法的建立及其应用为EMCV田间样本检测及实验室研究提供了可靠的方法和具有参考价值的试验数据。