鱼源产酶贝莱斯芽孢杆菌的分离筛选及其对鲤益生作用的研究

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随着集约化水产养殖的普及,水产动物疾病频发,抗生素和化学药物滥用导致病原菌的耐药性和农药残留等不良后果,给人们的健康造成严重的威胁。益生菌作为抗生素替代品在水产养殖中有着极大的应用前景,产酶益生菌还能分泌多种消化酶,特别是β-甘露聚糖酶(β-mannanase)能有效地降解饲料中的非淀粉多糖等抗营养因子,促进肠道消化吸收,因此研究和开发产酶益生菌菌株对促进水产养殖业健康发展有着很重要的意义。本研究以健康鲤(Cyprinus carpio)为试验材料,设计12种培养基从鲤肠道中分离纯化了107株菌,共包括3个门22个属。初筛发现产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、β-甘露聚糖酶的菌株有16株,复筛发现产β-甘露聚糖酶的菌株HF-14109,根据形态学观察、生理生化鉴定、16S r RNA鉴定分析和全基因序列分析,最终确定其为贝莱斯芽孢杆菌HF-14109(Bacillus velezensis HF-14109)。产酶菌株HF-14109具有较好的抑菌能力,对高温、酸性和胆盐有较好的耐受性,对多种抗生素敏感,而且还能产生多种消化酶,特别是其β-甘露聚糖酶的酶活力最适温度为45℃和最适p H为6.0,在温度20℃-50℃,p H 4.0-9.0范围内都较为稳定,Cu2+、Fe3+、Zn2+、Ba2+对该酶具有激活作用,而Mn2+、Mg2+、Ca2+对该酶具有抑制作用;贝莱斯芽孢杆菌HF-14109(B.velezensis HF-14109)的生物学特性、酶学特性研究和安全性试验表明该菌株可作为潜在的水产饲料添加剂。通过在饲料中添加不同浓度(10~7 CFU/g、10~8 CFU/g、10~9CFU/g)的产酶菌株HF-14109,在30 d和60 d取样,试验结束后,分别进行酶活测定、实时荧光定量、组织HE染色及肠道菌群16S r RNA检测以探究其对鲤生长、抗氧化、血清生理生化指标、免疫相关因子和肠道组织形态、消化酶酶活、肠道紧密连接蛋白基因的表达及肠道菌群的影响,为鱼源产酶贝莱斯芽孢杆菌在水产饲料中的应用提供理论支撑。结果如下:(1)产酶菌株HF-14109对鲤生长性能、血清生理生化指标的影响与对照组相比,处理组增重率(WGR),特定生长率(SGR)都有明显的升高,饲料转化率(FCR)明显的降低,特别是10~8 CFU/g处理组。在60 d时,WGR、SGR显著高于对照组和其他处理组(P<0.05),FCR显著低于对照组和其他处理组(P<0.05);鲤血清中葡萄糖(GLO)、碱性磷酸酶(AKP)、高密度脂蛋白(HDL)、溶菌酶(LZM)显著高于对照组(P<0.05);酸性磷酸酶(ACP)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)显著低于对照组(P<0.05);处理组肝胰腺总抗氧化能力(AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量及谷胱甘肽(GSH)和过氧化氢酶(CAT)活性均显著升高(P<0.05),丙二醛(MDA)显著降低(P<0.05)。(2)产酶菌株HF-14109对鲤头肾、肾脏、脾及血清免疫相关因子的影响与对照组相比,处理组头肾、肾脏和脾中抗炎细胞因子白细胞介素10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)m RNA的表达量显著上升(P<0.05)。头肾中促炎细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)m RNA的表达量显著下降(P<0.05),脾中促炎细胞因子TNF-αm RNA的表达量显著降低(P<0.05),但脾中IL-1β、IL-6和肾脏中IL-6 m RNA的表达量显著上升(P<0.05),肾脏中IL-6 m RNA的表达量也显著上升(P<0.05);在饲喂60 d时,产酶菌株HF-14109显著增强血清中抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的表达水平,降低促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平(P<0.05)。(3)产酶菌株HF-14109对鲤肠道组织形态、消化酶酶活、肠道紧密连接蛋白基因的表达及肠道菌群的影响与对照组相比,处理组显著提高了鲤前肠、中肠和后肠绒毛长度、肠壁厚度、淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、β-甘露聚糖酶酶活和肠道紧密连接蛋白(Claudin-2、Occludin、ZO-1)m RNA的表达量均显著高于对照组(P<0.05);饲料中添加产酶菌株HF-14109能改善鲤肠道菌群的组成,与对照组相比,门水平上,处理组变形菌门(Proteobacteria)的丰富度显著增加(P<0.05),梭杆菌门(Fusobacteriota)、厚壁菌门(Firmicutes)的丰富度显著降低(P<0.05)。属水平上,处理组Vibrionaceae spp.、Limnohabitans spp.、芽孢杆菌属(Bacteria spp.)的丰富度显著增加(P<0.05),单胞菌属(Aeromonas spp.)、拟杆菌属(Bacteroides spp.)的丰富度显著降低(P<0.05)。综上所述:饲料中添加适宜浓度的贝莱斯芽孢杆菌HF-14109(B.velezensis HF-14109)可以促进鲤生长,改善机体免疫力,增强抗氧化能力、血清生理生化指标和肠道消化酶活性、肠粘膜屏障功能、改善肠道菌群的组成。
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